Métodos Eletroforéticos de Análise

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1 1 Métodos de Separação - Análise QUALI e QUANTITATIVA de substâncias. Métodos Cromatográficos -Cromatografia em papel -Cromatografia em camada delgada -Cromatografia em fase gasosa -Cromatografia em fase líquida Métodos Eletroforéticos -Eletroforese Capilar -Eletroforese em Microchips -Eletroforese em gel -Eletroforese bi-dimensional Métodos Eletroforéticos de Análise Mecanismos de Separação: Eletroforese Capilar em Solução Livre 2 Eletroforese Capilar - Definições 3 Técnica de separação baseada nas diferentes velocidades de migração apresentadas pelos analitos, quando submetidos à ação de um elevado campo elétrico. Técnicas de Eletromigração em Capilares: Família de técnicas que empregam campo elétrico na separação e/ou na movimentação dos analitos em sistemas capilares. Terminology and Nomenclature in Capillary Electroseparation Systems Knox, H. J.; J. Chromatogr. A 1994, 680, Terminology for Analytical Capillary Electromigration Techniques Riekkola, M. L.; Jönsson, J. A.; Smith, R. M.; Pure Appl. Chem. 2004, 76(2),

2 4 Eletroforese em Capilares Eletroforese em Microchips Eletroforese em Gel Focalização Isoelétrica Eletroforese Bidimensional Aplicações 5 Objetivos - Compreender o funcionamento do mecanismo de separação relacionado à separação eletroforética em solução livre. - Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação. - Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e mobilidade eletrosmótica. - Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida. - Familiarizar com a instrumentação básica. Eletroforese Capilar 6 Detector Controle Capilar Fonte de Alta Tensão Tampão Amostra L T = cm Tampão 2

3 Sinal do Detector (U.R.) Fluxo Eletrosmótico (EOF) 7 Fluxo Laminar (pressão) EOF 8 Eletroforese Capilar 1,3 1,2 1,1 1, Tempo (min) Mobilidade Eletroforética 9 n plug capilar l (comprimento até o detector) L (comprimento total) Detector s v t l v t m 3

4 tempo de migração (min) Sinal (U.R) Efeito do Potencial Aplicado 10 2,0 Ca 2 Na Mg2 K Li 1,5 1,0 5,0 kv 7,5 kv 0,5 0,0-0,5 10 kv 20 kv 25 kv Tempo (min) Mobilidade Eletroforética 11 v l t m V v ee e L (1) (2) Combinando-se (1) e (2), temos: l t m V e L e ll t V m t m ll V e Tempo de Migração Potencial (kv) 4

5 Corrente (A) Quanto maior o potencial, mais rápida a análise? U = R x i 3 2 y = ax b a = 1/R Potencial (kv) Controle de Temperatura 14 Efeito Joule Dispersão (s 2 ) 15 Efeito Joule Decréscimo no campo elétrico Efeito proporcional na geração de calor Reduz a eficiência e resolução Redução do diâmetro do capilar Decréscimo significativo na corrente Diminui a sensibilidade Pode causar aumento na adsorção Decréscimo na concentração do tampão Decréscimo proporcional da corrente Pode causar aumento na adsorção Controle ativo da temperatura Termostatos; remoção de calor do capilar 5

6 Fluxo Eletrosmótico (EOF) Estrutura da sílica fundida Si O O Si OH Silanol isolado Si O O Si O O H Si O Si O Silanóis vicinais Si Si O O O O Si Si H O - Silanol dissociado Si Si O O O O Si Si O Siloxano OH Silanóis geminais OH 16 Fluxo Eletrosmótico (EOF) Fenômenos Eletrocinéticos 17 Eletrosmose Potencial de fluxo (streaming potential) Oldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic Press, San Diego, CA, USA, Fluxo Eletrosmótico (EOF) 18 IHP OHP CAPILAR O O O O O O O H H H H H - - H H - PC (z ) 6

7 Resposta (UR) 12,5496 8,4888 Resposta (UR) 41, , Alguns parâmetros... tm2 tm 1 R 2 w1 w2 N t m 16 wb 2 t m2 t m1 w b1 w b2 20 0,35 0,30 Exemplo 1 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 w b1 = 7,35 w b2 = 9, Tempo (s) 21 0,35 0,30 Exemplo 2 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 w b1 = 3,56 w b2 = 4, Tempo (s) 7

8 Resposta (UR) 27,972 18,9 22 0,30 Exemplo 03 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 w b1 = 5,11 w b2 = 7, Tempo (s) Fluxo Eletrosmótico (EOF) 23 Fatores que afetam o EOF ph (z) Potencial Aplicado (E) Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z) Temperatura (h) Solventes Orgânicos (h, e, z) Modificação da Superfície do capilar Aplicação de um potencial radial externo Fluxo Eletrosmótico (EOF) 24 Fatores que afetam o EOF ph EOF / 10-4 cm 2 V -1 s -1 8

9 Fluxo Eletrosmótico (EOF) 25 Fatores que afetam o EOF Concentração EOF / 10-8 m 2 V -1 s Como medir o EOF? 26 Sinal de um marcador Neutro Monitoramento da corrente que flui pelo capilar ll eof t V eof Monitoramento do EOF 27 9

10 Monitoramento do EOF 28 HV Detector 0 V (a) (b) (c) Monitoramento do EOF 29 OPT x Objective Microchip HVPS Diaphragm & Len Filter White LED 5,5 V dc Monitoramento do EOF 30 10

11 OPT101 Output / V Current / A Monitoramento do EOF OPT101 Current time / s Polaridade Normal 32 CAPILAR O O O O O O O H H H H H - - H H - 33 Eletroforese Capilar Detector Controle Capilar Fonte de Alta Tensão Tampão Amostra L T = cm Tampão 11

12 eof a = 0 Polaridade Normal 34 CAPILAR O O O O O O O H H H H H - - H H - 35 Eletroforese Capilar - Técnica de separação baseada na diferença de mobilidade (velocidade) de compostos iônicos ou ionizáveis sob ação de um campo elétrico. v ep E ep ze 6hr Mobilidade Aparente 36 a ef eof a > 0 ef eof a ef a eof a < 0 ef 12

13 Fluorescência (URF) Análise de Cátions 37 a ef eof Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm 2 V -1 s -1. Considerando o valor de eof = 1,010-4 cm 2 V -1 s -1, calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie analisada. Análise de Ânions 38 a ef eof a < 0??? Análise de Ânions 39 0,4 0,3 0,2 0,1 Poliéster-toner Fluxo Normal app = ep eof 0,6 0,4 0,2 eof FL ep 3,0x10 Poliéster-toner Fluxo Invertido 4 CM 5 1,0 x10 ap??? 0, Tempo (s) 0,

14 Fluorescência (URF) Fluorescência (URF) Fluorescência (URF) Análise de Ânions 40 0,4 0,3 Poliéster-toner Fluxo Normal 0,6 FL Poliéster-toner Fluxo Invertido 0,2 app = ep eof 0,4 CM 0,1 0,2 0, Tempo (s) 0, Eficiência da Separação 41 0,3 0,2 t m N 16 wb Toner preto (Imp. Monoc.) 2,0 1,5 2 Toner preto (Imp. Colorida) 1,0 0,1 0,5 0, Tempo (s) 0, Tempo (s) Resolução 42 tm2 tm 1 R 2 w1 w2 1 R 4 N _ t m2 t m1 w b1 w b2 1 R 4 2 V _ D EOF 1/2 14

15 Fluorescência (ua) Fluorescência Resolução 43 PDMS Nativo 0,1 URF R=1,9 R=1,8 R=2,7 R=2,6 R=2,4 R=2,7 R=3, Tempo (s) Resolução 44 0,9 0,8 Poliéster-toner 0,7 0,6 R = 2,3 R = 1,9 R = 1,6 R = 1,4 R = 1,5 R = 1,6 0,5 R = 2,7 0,4 0,3 0, Tempo (s) Seletividade (a) 45 Outros fatores que afetam a seletividade: -EOF -Temperatura -Composição do tampão -Adsorção à parede do capilar Tampão: Borato 100 mm; Capilar 25 m, 17 cm até o detector; Potencial 30 kv; Detecção UV em 200 nm. 15

16 360 m Instrumentação Básica 46 Fonte de Alta Tensão D Pt Reservatórios Instrumentação Básica 47 Capilares Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK Comprimento: 20 a 70 cm Diâmetro Interno: 20 a 75 m Fonte de Alta Tensão Potencial: 0-30 kv Corrente: 400 A Potência: 12 W 75 m Controle de Temperatura Injeção de Amostra Detecção Coleta de Frações Injeção da Amostra 48 A introdução da amostra no capilar pode ser feita de duas maneiras: Aplicando-se pressão ao capilar Injeção Hidrodinâmica Pressão positiva ou negativa Gravidade Utilizando-se campo elétrico Injeção Eletrocinética 16

17 Injeção da Amostra 49 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão) P P 4 Pr t V 8hL V : Volume Injetado P : Gradiente de Pressão r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção h : Viscosidade L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 50 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade) 4 rghr t V 8hL h V : Volume Injetado r : Densidade g : Aceleração da Gravidade h : Diferença entre os níveis r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção h : Viscosidade L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 51 Injeção Eletrocinética da Amostra Fonte AT 2 Vctr Q L ep eo Q : Quantidade de Material Injetado c : Concentração r : Raio do Capilar t : Tempo de Injeção ep : Mobilidade Eletroforética eo : Mobilidade do FEO L : Comprimento do Capilar 17

18 Injeção da Amostra 52 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t 0 = 0 E K Na H 2 0 Injeção da Amostra 53 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t 1 > 0 E K Na H 2 0 Injeção da Amostra 54 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) 18

19 Injeção da Amostra 55 Aspectos Práticos O volume injetado não deve exceder 10 % do volume total do capilar. Isto corresponde a um volume em torno de 50 a 100 nl. Na injeção eletrocinética há a discriminação da amostra. Variações na composição da amostra afetam a quantidade injetada. Padrão interno Introdução 56 Detecção Direta ou Indireta?? Métodos Ópticos 57 19

20 Absorção UV-vis 58 b I o I T I I 0 A log T ebc Absorção UV-vis 59 Absorção UV-vis 60 Detecção UV-vis mono-canal 20

21 Absorção UV-vis 61 Detecção UV-vis mono canal - Exemplos Absorção UV-vis 62 Detecção UV-vis multi-canal Absorção UV-vis 63 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos 21

22 Absorção UV-vis Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos 64 Eletroforese em Microchips 65 L T = 3-5 cm Eletroforese em Microssistemas 66 22

23 67 68 Aplicações: Microchips descartáveis de poliéster-toner para análises genéticas 23

24 Fluorescence Separação de DNA em microchip de PT Eletroforese em Gel para separação de DNA Baseado no tamanho dos fragmentos de DNA Gel: solução polimérica que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho Eletroforese: separação de fragmentos de DNA no gel através da aplicação de um campo elétrico DNA Canal preenchido com gel Introdução do DNA no gel Eletroforese e separação do DNA através do gel - Produção do dispositivo de PT I 2 II canal 1 3 III IV V b 4 (I). Filme de poliéster, (II). Filme de poliéster impresso a camada de toner, (III). Alinhamento das duas partes, base e topo, (IV). Laminação, (V). Dispositivo pronto com os reservatórios com os reservatórios (b). Visão do topo do microdispositivo de PT. (1) reservatório da amostra, (2) reservatório do tampão, (3) reservatório de descarte da amostra e (4) reservatório de descarte do tampão 72 5 RFU 12 m Time (s) 0,5% hidróxi-etil-celulose (HEC kda) Duarte, G.M.R; Coltro, W.K.T.; Carrilho. E. Electrophoresis,

25 Microchip de PT para SPE e PCR (I) (II) (III) (IV) Cada camada de toner: 6 m Cada poliéster filme: 100 m Representação das etapas do processo de microfabricação, (I) filme de poliéster (II) filme de poliéter recoberto com toner nos dois lados (III) canal cortado com a cortadora a laser, (IV) alinhamento e laminação das quatro camadas de poliéster (base, tampa com dois furos para os reservatórios e os dois filmes do meio com os canais ). Laser Cutting 74 Extração dinâmica de DNA em fase sólida Preenchimento (dspe) o canal com 8M GuHCl, ph 7.6 Adição de 1.2l de Magnesil Adição de 2 l de amostra Agitação por 5 no agitador magnético Lavagem com 6 l 80% IPA Lavagem com 4x 2 L 0.1X TE Eluição com 0.1x TE com 2 agitatação para cada fração Recolhimento de 8 frações após o início do movimento 25

26 DNA (ng) Microchip: 4 filmes de poliéster Profundidade do canal: 272 m volume:4 L cm Preparo das amostras: Sangue: 6 L de sangue, 5 L de proteinase K, 9 L de GuHCl 8 mol/l 1% triton 56 C por 10 min dspe: mesmo princípio da dspe em microchip de vidro - Partículas magnéticas de sílica - fase sólida dinâmica Extração dinâmica de DNA em fase sólida (dspe) Perfil de eluição da extração de DNA em sangue Elution Profile of Blood in a Toner Chip ~ 35% é eluído na primeira fração ~ 75% é eluído nas três primeiras frações Volume (ul) Eficiência de Extração: 69.7 ± 5.7% Exemplos 78 26