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1 Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra Armando Cristóvão Adaptado de "The Tools of Biochemistry" de Terrance G. Cooper Como funciona um espectrofotómetro O espectrofotómetro é um aparelho capaz de produzir luz monocromática (luz de um comprimento de onda), e capaz de detectar de uma forma sensível a quantidade de luz absorvida por uma amostra a um dado comprimento de onda. Figura 1 - Representação esquemática do funcionamento de um espectrofotómetro. Zoologia (AJC) 1

2 A. A fonte de luz No caso de ter que usar comprimentos de onda na região UV, as lâmpadas de alta pressão de hidrogénio ou de deuterium, sendo esta última melhore pois é 3x mais intensa, e são utilizadas numa gama de comprimentos de onda entre aproximadamente 375nm até 250 nm (no caso de cuvetes de vidro) ou 160 nm (no caso de cuvetes de sílica). Acima de 375 nm são usadas lâmpadas de tungsténio de baixa voltagem e de alta intensidade. Actualmente são muito utilizadas lâmpadas de xenon, que permitem uma gama de comprimentos de onda entre nm, no entanto têm a desvantagem da intensidade oscilar devido ao arco. Para uma fonte de luz ser de boa qualidade deve: 1. Ter uma grande intensidade e uma pequena área de superfície. 2. Abranger uma grande gama do espectro. 3. Ter um espectro contínuo, sem grandes quebras nos comprimentos de onda emitidos. 4. Ter uma emissão estável. B. O monocromador e os filtros de comprimento de onda A luz proveniente de uma das lâmpadas de deuterium ou tungsténio é seleccionada por um sistema de espelhos e concentrada por um sistema de lentes (não representados na figura 1). Este raio concentrado passa por uma fenda estreita, indo atingir um prisma que vai decompor a luz branca nos diferentes comprimentos de onda. O prisma deve absorver o mínimo de luz, deve ser altamente preciso na selecção do comprimento de onda, deve formar um espectro puro e não deve possuir comprimentos de onda sobrepostos. A selecção do comprimento de onda é efectuada através da rotação do prisma, por meios mecânicos ou de uma forma manual. Uma das desvantagens dos prismas é que a dispersão é limitado e o ângulo de desvio entre os diferentes comprimentos de onda não seguem uma regra geométrica - comprimentos de onda longos estão menos Zoologia (AJC) 2

3 espaçados que os comprimentos onda curtos. Este problema pode ser ultrapassado através do uso de grelhas de difracção, cuja superfície espelhada impede a reflexão contínua do feixe, sendo emitidos feixes paralelos (Figura 2). Para funcionar correctamente estes sulcos reflectores deverão estar a uma distância tal por forma às ondas dum sulco não interferirem nas ondas dos sulcos da onda vizinha. Deste modo só são transmitidas as ondas que estão em fase. A luz transmitida desta forma pode no entanto conter comprimentos de onda misturados, que podem ser resolvidos através da colocação de filtros que impeçam a passagem de determinado comprimento de onda (por exemplo: para usar a 750 nm colocar-se-ia um filtro que impedisse a passagem de comprimentos de onda inferiores a 500nm e superiores a 850 nm). Luz incidente Luz incidente Figura 2 - Resultado da reflexão de diferentes ondas de luz numa grelha de difracção. Como se mostrou na figura 1, a luz que chega à amostra, é a que após passar o monocromador atravessa a fenda de saída. Quanto mais estreita for esta fenda menor é a gama de comprimentos de onda que chegam à amostra, designando-se esta gama de comprimentos de onda que atinge a amostra de espectro da fenda. Quanto menor for o espectro da fenda maior será a resolução da amostra. O monocromador não deve apenas possuir um feixe com uma gama de comprimentos de onda reduzida, é também necessário que o comprimento de onda seja correcto. Na prática para se saber se um monocromador é suficientemente preciso, utilizam-se determinadas substâncias que se conhece muito bem o seu Zoologia (AJC) 3

4 espectro de absorção, verificando-se desta forma se os picos de absorção estão aos comprimentos de onda correctos. C. A câmara para colocar amostras e os porta amostras (cuvetes) Actualmente existe uma grande variedade de cuvetes que é possível colocar na câmara, indo desde os clássicos tubos de vidro (como é o caso do antigo spectronic 20) a uma gama de cuvetes que suportam os mais variados volumes (os mais usuais vão desde 50 µl a 5 ml ). As cuvetes são um ponto importante do espectrofotómetro, pois para se trabalhar em determinadas gramas de comprimento de onda são necessárias cuvetes de materiais especiais. Para medições na gama visível, ( nm) cuvetes de vidro são suficientes, podendo ainda ser usadas cuvetes de plástico preparadas para o efeito. No entanto para gamas de comprimento de onda inferiores a 375 nm (região UV), o vidro absorve muita radiação e por isso é necessário usar cuvetes de quartzo ou de sílica fundida. Actualmente existem também plásticos que permitem a utilização de cuvetes em determinadas gamas da região UV. D. O Detector O sistema de detecção de um espectrofotómetro consiste num tubo fotomultiplicador sensível à luz. Em instrumentos que permitem trabalhar num grande espectro, são necessários dois fotomultiplicadores diferentes: um mais sensível para a gama de comprimentos de onda entre nm, e outro mais sensível aos comprimentos de onda nm. O tubo fotomultiplicador converte os sinais de luz em sinais eléctricos. Uma parte do foto-tubo está coberta por um material sensível à luz - o fotocátodo. Quando um pulso de luz atinge esta superfície, uma série de electrões são libertados. Estes electrões são em primeiro acelerados através de um campo eléctrico de V e atingem o primeiro "dynode". Para assegurar que todos os electrões atingem este "dynode", existem uns anéis carregados negativamente à entrada deste circuito. Por cada electrão que atinge o "dynode", 5 a 6 electrões são libertados e irão atingir o Zoologia (AJC) 4

5 "dynode" seguinte, numa amplificação em cascata 10 a 14 vezes, atingindo o 14º "dynode" 10 6 electrões por cada electrão que atinge o primeiro "dynode", num intervalo de tempo de 10-9 s. Durante este tempo o fotocátodo não aceita electrões, e designa-se de tempo morto. Existem dois métodos para medir a absorção. O método em que apenas existe uma amostra, o que implica que para cada medição que é feita para uma amostra deverá ser feita uma medição de um branco, para saber as contribuições dos solventes e de materiais indesejáveis da amostra. Por exemplo se uma amostra der uma absorvância de 0,8 e se determinar que o branco tem uma absorvância de 0,4, deverá alterar o método por forma a ser melhorada pois é um valor para o branco demasiado elevado. O valor do branco nunca deverá ser superior a 10 % do valor observado numa amostra. No caso de fazer espectros, valores acima do referido não são aceitáveis, podendo no entanto ser aceites no caso de medições únicas de uma amostra. Para se resolver este problema foram desenvolvidos espectrofotómetros de feixe duplo. Desta forma, um feixe atinge a amostra enquanto outro simultaneamente atinge a referência. Estes dois sinais atingem os fotomultiplicadores que de uma forma controlada electronicamente, subtrai o valor de luz da referência à amostra. Isto, permite medições contínuas de espectros, com a correcção automática do branco. Em conclusão, os passos que a luz percorre num espectrofotómetro são Funcionamento: 1. A luz branca emitida pela lâmpada passa através de uma rede de difracção (ou prisma óptico) no monocromador e é separada nos vários comprimentos de onda do espectro visível. 2. O comprimento de onda desejado é seleccionado através de um selector que roda o monocromador de maneira a que um estreito feixe de luz passe através de uma pequena abertura (fenda) e vá atingir a amostra. 3. Parte da intensidade do feixe luminoso que incide na amostra é absorvida, sendo a restante parte transmitida. A luz transmitida vai impressionar um detector (fototubo ou célula sensível) que a transforma num sinal eléctrico muito pequeno. Zoologia (AJC) 5

6 4. O sinal eléctrico gerado no detector é transmitido para um amplificador de sinal, onde a sua intensidade é aumentada. 5. O sinal amplificado vai ser recebido por um voltímetro, que dá a leitura da quantidade de luz que foi transmitida pela amostra. O mostrador pode indicar tanto unidades de absorvância como de transmitância. Bibliografia Atkins, P and Jones, Loretta (1997). Chemistry:Molecules,matter and change, 3rd ed, ed W.H.Freeman New York Cooper, Terrance G. (1977). The tools of Biochemistry ed Jonh Wiley and Sons, New York Zoologia (AJC) 6

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