fase fixa (quer em coluna quer em superfície plana) pode ser um líquido depositado num suporte sólido inerte (GC)

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1 Cromatografia Cromatografia técnica baseada nas diferenças de distribuição dos componentes a separar entre duas fases: uma fase móvel e uma fase estacionária. técnica em que os componentes duma mistura se separam de acordo com as velocidades às quais são transportados por uma fase móvel através de uma fase estacionária fase móvel (eluente) fase que se move gás - cromatografia em fase gasosa - GC) líquido - cromatografia em fase líquida - LC fase estacionária fase fixa (quer em coluna quer em superfície plana) normalmente um sólido activo eluição pode ser um líquido depositado num suporte sólido inerte (GC) processo de passagem através da fase estacionária (por acção da fase móvel)

2 Cromatografia - Evolução histórica Runge mistura de tintas em papel mata-borrão Schoenbein - Goppelsroder sais, água, vinho, leite, urina,... / separação por capilaridade Tswett pigmentos de plantas / coluna de giz moído (carbonato de cálcio) Ismailov e Schraiber ( Stahl) primeira descrição do TLC / CCF - camada fina / uso de alumina na separação de tinturas farmacêuticas Martin e Synge (prémio Nobel em 1952) cromatografia de partilha (aminoácidos) / cromatografia gás-líquido Huber e Hulsman desenvolvimento da cromatografia Líquido-Líquido (HPLC) uso de partículas de 5 a 10 µm / pressão elevada 12 Prémios Nobel (entre 1937 e 1972) estão directamente relacionados com trabalhos em cromatografia

3 Cromatografia - classificação quanto à forma do suporte coluna - a fase estacionária está confinada num tubo por onde é forçada (pressão / gravidade) a passagem da fase móvel planar (camada fina / papel) - fase móvel avança por capilaridade ou gravidade quanto aos processos físico-químicos adsorção - separação baseada nas diferenças de afinidades adsorventes dos componentes pela superfície do sólido activo partilha - separação baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (GC) ou entre a duas fases (LC) permuta iónica - separação baseada nas diferentes tendências dos componentes iónicos ou ionizados à permuta com iões da fase estacionária quanto à natureza da fase móvel: fase gasosa (GC) / fase líquida (HPLC) / fluido supercrítico (SFC) quanto à forma de introdução da amostra frontal - contínua (eluição após a saturação da fase estacionária) não permite a separação entre todos os componentes da mistura zonal - descontínua (permite a separação total) A A+B A+B+C

4 Cromatografia - classificação quanto ao objectivo da separação analítica - controlo de qualidade (impurezas / pureza / doseamentos) preparativa - produção / purificação (evita as técnicas de extracção química) quanto à composição da fase móvel isocrática - composição do eluente constante ao longo da eluição gradiente - composição do eluente varia de forma contínua quanto ao modo de operação análise por deslocamento fase móvel saturada com substância de maior afinidade para com a fase estacionária, deslocando os componentes da amostra de acordo com os respectivos graus de afinidade. análise por eluição a fase móvel passa continuamente na coluna arrastando a amostra e provocando o processo de separação. A separação dos componentes da mistura depende apenas do seu coeficiente de partilha entre as fases móvel e estacionária análise por gradiente de temperatura a separação é feita por um gradiente térmico no sentido da eluição da amostra isotérmica / temperatura escalonada / temperatura programada linearmente

5 Métodos cromatográficos Cromatografia - processo de separação que exige um equilíbrio competitivo entre a fase estacionária a fase móvel e as moléculas da amostra. Cromatograma - registo da concentração do soluto vs. tempo (volume) de eluição Cromatógrafo - equipamento constituído por sistema de injecção, coluna e detector adequado para a realização de separação (análise) e quantificação de misturas. Tipo de cromatografia fase móvel fase estacionária processo de distribuição Cromatografia de partilha (coluna) L L partilha Cromatografia de papel L L partilha Cromatografia gás-líquido (GLC) G L partilha Cromatografia de adsorção (coluna) L S adsorção Cromatografia em camada fina (TLC) L S adsorção Cromatografia gás-sólido (GSC) G S adsorção Cromatografia permuta iónica L S reacção química reversível Cromatografia de permeação gel L S crivagem molecular

6 Conceitos e equações básicas Separação dos componentes separação aumenta com o tempo de eluição (devido às diferenças de afinidades) Alargamento dos picos (bandas) os picos tendem a alargar com o tempo de eluição (diminuição da eficiência de separação) A eficiência da separação cromatográfica depende das velocidades relativas de eluição e, consequentemente, dos respectivos coeficientes de partilha Coeficiente de partilha (K) razão entre a concentração na fase estacionária (C S) e a concentração na fase móvel (C M ) idealmente, K é constante!! K = C CS Coeficiente de retenção (R r ) razão entre a velocidade média do soluto e a velocidade média do eluente Factor de retenção (R f ) - muito usado em TLC razão entre a distância percorrida pela banda e a distância percorrida pela frente do eluente no mesmo tempo. Questão: um solvente atravessa uma coluna em 3 minutos mas o soluto demora 9 minutos a eluir! Qual a fração do tempo que o soluto passa na fase móvel? M

7 Conceitos e equações básicas Tempo morto (tm) tempo necessário para um produto não retido atravessar a coluna Tempo de retenção (t r ) tempo que decorre desde a injecção até meia eluição Tempo de retenção relativo (t rr ) tempo de retenção calculado em relação ao pico t m t principal (ou de referência) r1 Volume de retenção (V r ) volume de eluente introduzido desde a injecção até meia eluição Velocidade média de eluição L v = t r Factor de capacidade (k ) descreve a velocidade com que dado composto migra ao longo da coluna valores típicos estão entre 1 e 5 em GC, k varia mudando a temperatura e o enchimento da coluna em LC, k varia alterando a composição da fase móvel e da fase estacionária t r2 t r - t m k = t m

8 Conceitos e equações básicas Factor de selectividade razão entre os coeficientes de partilha do soluto mais retido pelo menos retido medida da separação de dois solutos α é sempre superior a 1 Forma dos picos tipicamente gaussianos (simétricos) alargamento resulta da variações de velocidade das moléculas de soluto ao longo da coluna - o tempo de residência em cada fase não é constante Tailing - arrastamento provocado por coeficientes de partilha não lineares Fronting - provocado por coef. partilha não lineares / amostra demasiado grande Modelos que descrevem a separação cromatográfica Modelo de equilibrio - modelo dos pratos teóricos Modelo dinâmico modelo cinético KB K' B t α = = = K K' t A A rb ra t t m m

9 Modelo dos pratos teóricos considera transferências sucessivas entre as quais se estabelece termodinâmico / em vez de considerar o avanço real da fase móvel cada volume assim definido é um prato teórico N = L / H em que L - comprimento da coluna e H (HETP) - altura do prato teórico equilíbrio a eficiência de uma coluna aumenta com o número de pratos (ou inv. a H), podendo variar de algumas centenas (HPLC) a várias centenas de milhar (GC) Considerando uma distribuição aproximadamente gaussiana, N pode ser obtido por: ω é a largura do pico na base (considerando tratar-se de um triângulo) δ é a largura a meia altura do pico N = 16 (t r /ω) 2 ou N = 5,54(t r / δ) 2 A largura do pico representa uma boa medida da eficiência da coluna (permitindo a comparação entre colunas) Apesar do modelo não caracterizar os vários parâmetros que influenciam a separação, a sua simplicidade favorece a utilização ω

10 Modelo cinético a separação cromatográfica é um fenómeno cinético e não estático a deformação dos picos está associada ao fluxo da fase móvel e pode ter várias origens: existência de vários trajectos possíveis (anisotropia) difusão molecular longitudinal resistência à transferência de massa Anisotropia é independente do fluxo exprime o movimento turbulento de difusão da fase móvel através da fase estacionária reflecte a homogeneidade da fase estacionária (enchimento) diminui com o diâmetro das partículas e é nula para uma coluna vazia H A = dp λ = A dp - diâmetro das partículas l - irregularidade do enchimento

11 Modelo cinético Difusão longitudinal representa a dispersão das moléculas inversamente proporcional ao fluxo H b = B / U B - difusão U - velocidade da fase móvel Resistência à transferência de massa as moléculas colocadas no centro do fluxo avançam mais rapidamente a fase estacionária não tem uma forma regular - diferenças de retenção das moléculas as diferenças (desfasamento) aumentam drasticamente com o fluxo provocando o alargamento progressivo do pico H c = C. U C - transferência entre fases U - velocidade da fase móvel

12 Equação de van Deemter H = A + B // U + C.. U H representa a altura equivalente de um prato teórico N = L / H A - anisotropia B/U - difusão C.U - transferência A separação é máxima para H mínimo. H B domina para U baixos e C domina para U elevados A difusão é muito menos significativa em HPLC (líquido). A é também menor em HPLC pelo que H min é cerca de 10x menor que em GC e obtem-se para valores de U cerca de 10x inferiores. U - velocidade da fase móvel Os picos tendem a alargar mais em GC que em HPLC.

13 Partículas

14 Resolução Resolução de uma coluna mede a capacidade de separar dois solutos R = 2( trb tra) N α 1 k' B = w + w 4 α 1+ k' B é o soluto mais lento ( maior t r ) A B B A resolução depende de 3 factores: selectividade α deve ser superior a 1 (importante mas insuficiente) factor de capacidade k - deve estar compreendido entre 1 e 10 eficácia da coluna N - deve ser a maior possível (ainda que seja pouco influente - raiz quadrada) R = 1 - separação quase completa R > 1,5 - separação completa Nota: é muitas vezes exigida um R de 4-5 para que as impurezas existentes sejam separadas.

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