SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

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1 SEPRÇÃO CROMTOGRÁFIC CLSSIFICÇÃO DE MÉTODOS CROMTOGRÁFICOS EM COLUN Classificação geral Método específico Fase estacionária Tipo de equilíbrio mostra Fase móvel Cromatografia líquida (LC) (fase móvel: líquido) Líquido-líquido ou partição Líquido adsorvido num sólido Partição entre líquidos imiscíveis + Líquido-fase ligada Espécies orgânicas ligadas Partição líquido/superfície ligada a uma superfície Líquido-sólido ou adsorção sólida Sólido dsorção Troca iónica Resina de troca Troca iónica iónica Exclusão por tamanho Líquido nos interstícios de um Partição/peneiragem sólido polimérico Cromatografia gasosa Gás-líquido Líquido adsorvido Partição gás/líquido Detector (GC) (fase móvel: gás) Gás-fase ligada num sólido Espécies Partição gás/superfície Sinal do detector t 0 t 1 t t 3 t 4 t 0 t 1 t t 3 t 4 Cromatografia de fluido supercrítico (SFC) orgânicas ligadas ligada a uma superfície sólida Gás-sólido Sólido dsorção Partição fluido supercrítico/superfície ligada (fase móvel: fluido supercrítico) 1

2 TEORI D CROMTOGRFI SEPRÇÃO CROMTOGRÁFIC t 1 Fase móvel Fase estacionária C K = C S M Concentração t LRGMENTO DE ND Comportamento ideal Distância migrada MELHORNDO SEPRÇÃO Resposta do detector Comportamento real Sinal do detector Cromatograma original umento da separação das bandas Diminuição do alargamento das bandas

3 LGUMS QUNTIDDES IMPORTNTES QUNTIDDES IMPORTNTES (CROMTOGRM) de retenção (T r ) T r T r = T estacionária + T móvel Sinal do detector T m T r W 1/ morto (T m ) de retenção ajustado (T r ) T r = T r - T m 0 Factor de retenção (k ) medida de retenção na fase estacionária T m = tempo morto T r = tempo de retenção total T r = tempo de retenção ajustado (ou líquido) W 1/ = largura do pico a meia altura que o analito passa na fase estacionária k' = = que o analito passa na fase móvel Tr Tm Tr ' = = Tm Tm Coeficiente de separação ou selectividade (α) medida de retenção na fase estacionária a = k' = k' 1 ( Tr ) Tm ( Tr ) Tm 1 3

4 LTUR EQUIVLENTE UM PRTO TEÓRICO PROCESSOS CINÉTICOS QUE CONTRIUEM PR O LRGMENTO DOS PICOS Nº de moléculas (L-1σ) L (L+1σ) Processo Termo na equação Relação com as propriedades da Difusão longitudinal H = CS u CMu u + + u coluna e do analito k D = D M u u Distância migrada Transferência de massa (fase estacionária líquida*) u C S qk' d u C f Su = ( 1 + k' ) DS Introdução da amostra Enchimento DETERMINÇÃO DE H E N Detector Transferência de massa (fase estacionária sólida**) Transferência de massa (fase móvel) u C S u C M t k' u C u d S = ( 1 + k' ) f(dp,dc,u ) CMu = u DM Sinal do detector T m T r W f: função de ; k D, q : constantes; t d tempo médio de dessorção do analito da superfície; d c : diâmetro da coluna; : coeficiente de difusão longitudinal; C S e C M : coeficientes de transferência de massa nas fases estacionária e móvel, respectivamente. * a fase estacionária é um líquido imiscível imobilizado ** a fase estacionária é uma superfície sólida onde ocorre adsorção. Variável Símbolo Unidades Velocidade linear da fase móvel u cm.s -1 Coeficiente de difusão na fase móvel (a) DM cm.s -1 Coeficiente de difusão na fase estacionária (a) DS cm.s -1 Coeficiente de capacidade k - Diâmetro de partícula do enchimento dp cm Espessura do revestimento líquido na fase estacionária df cm (a) umenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui 4

5 EQUÇÃO DE VN DEEMTER LRGMENTO DE NDS Contribuição para H, cm H = + C u u S + C M u H C S u C M u Efeito de percursos múltiplos 1 Largura de banda inicial /u Velocidade linear de fluxo, cm/s Largura de banda final glc Fase móvel estagnada GLC 0.6 Fluxo de fase móvel H, mm LC 0. Grau de alargamento de banda Velocidade linear de fluxo, cm/s lc 5

6 SEPRÇÃO E RESOLUÇÃO R S =0.75 LRGUR DE PICO N SE (W) E MEI LTUR (W 1/ ) Sinal do detector R S =1.0 Resposta do detector W 1/ =.35σ h T m (T r ) (T r ) Z R S =1.5 h W = 4σ W / W / W W 6

7 TÉCNICS PR MELHORR RESOLUÇÃO Objectivo: Separações eficientes em tempos de análise curtos. EFEITO DO COMPRIMENTO D COLUN N RESOLUÇÃO E NO TEMPO DE RETENÇÃO 1. umentar a distância entre os picos, T r =T -T 1 (a) umentar o comprimento da coluna, L (b) umentar a quantidade de fase estacionária, V S ou V L (c) Usar um coeficiente de selectividade melhor, α=t /T 1 Diminuir a temperatura Escolher uma fase estacionária diferente Escolher uma fase móvel diferente (se for líquida). Diminuir a largura da banda, W (a) Usar um enchimento mais uniforme Encher mais cuidadosamente Usar partículas mais pequenas (b) umentar a área de interface entre as fases (c) Optimizar a velocidade de fluxo (d) Reduzir o tamanho da amostra (e) Reduzir o espaço morto no sistema (f) Reduzir a constante de tempo do detector (g) Diminuir o diâmetro da coluna 7

8 EFEITO DO TMNHO DE PRTÍCUL E H EFEITO D TEMPERTUR N CG H, cm mm mm mm mm mm 1 x Isotérmica a 45ºC 5 Isotérmica a 145ºC Velocidade linear, cm/s 7 8 EFEITOS DO FCTOR DE CPCIDDE Programada de 30ºC a 180ºC Resolução, R S 4 R S /Q ou (T r ) /Q de eluição, (T r ) (min) Coeficiente de capacidade, k 30º 60º 90º 10º 150º 180º Temperatura (ºC) 8

9 EFEITO D COMPOSIÇÃO D FSE MÓVEL N CROMTOGRFI LÍQUID PRÂMETROS USDOS NS TÉCNICS DE OPTIMIZÇÃO 70% metanol, 30% água Variação de N lteração do comprimento da coluna 60% metanol, 40% água 50% metanol, 50% água 40% metanol, 60% água Variação de H lteração da velocidade do fluxo da fase móvel lteração do tamanho de partícula do enchimento lteração da espessura do filme líquido que serve de fase estacionária (LC) lteração do diâmetro da coluna lteração da viscosidade da fase móvel (e assim D M ou D S ) lteração da temperatura da coluna (GC) 1 9,10-antraquinona de retenção, min -metil-9,10-antraquinona 3 -etil-9,10-antraquinona 4 1,4-dimetil-9,10-antraquinona 5 -t-butil-9,10-antraquinona Variação de k e de a lteração da temperatura lteração da composição da fase móvel lteração do enchimento da coluna Utilização de efeitos químicos especiais 9

10 VRIÇÃO D RESOLUÇÃO EFEITOS DE a E N N RESOLUÇÃO DE PICOS T m Inicial Factor de separação fraco N pequeno Factor de separação bom N pequeno diminuir k aumentar k Variação de k umento de N Resposta do detector Factor de separação fraco N elevado Factor de separação bom N elevado umento de α 10

11 O PROLEM GERL D ELUIÇÃO Razão de altura dos picos = 1:1 R S = Sinal do detector Razão de altura dos picos = 8:1 R S =

12 Luís Herculano Melo de Carvalho Complementos de Química I SOREPOSIÇÃO DE PICOS SOREPOSIÇÃO DE PICOS 1) Localização Erro na quantificação por área de pico Posição aparente R s = 1 1:1 4:1 Posição verdadeira 100% 96% 8:1 16:1 ) Medição de áreas 93% 88% % erro na área do pico menor = (% indicada -100 %) % erro na área do pico maior = - (1/x) % erro na área do pico menor 1

13 EXPRESSÕES E QUNTIDDES IMPORTNTES EM CROMTOGRFI QUNTIDDES EXPERIMENTIS IMPORTNTES EM CROMTOGRFI Nome Expressão Relação com outras quantidades Nome Símbolo Determinada a partir de: morto T m Cromatograma s de retenção (de e de ) (T r) e (T r) Cromatograma (T r) e de retenção ajustado (de e de ) (T r) = (T r) - T m (T r) Largura de picos (de e de ) W e W Cromatograma Comprimento do enchimento da coluna L Medição directa Velocidade média das moléculas da fase móvel u Medição directa Volume da fase estacionária V S Dados da preparação do enchimento Concentração de analito nas fases móvel e estacionária C M e C S nálise e dados da preparação Velocidade linear da fase móvel Volume da fase móvel Coeficiente de capacidade Coeficiente de partição Factor de selectividade Resolução Nº de pratos ltura de prato de retenção ( T ) RS L u = T m VM = TmF k' = α = ( T T ) r m Tm k' VM K = VS ( Tr ) Tm ( Tr ) Tm KVS k ' = VM CS K = CM k' K α = = k' K [( Tr ) ( Tr ) ] = N α 1 k' RS = W + W 4 α 1 + k' Tr N = 16 W L H = N 16RSH α r = u α 1 ( 1 + k' ) ( k' ) 3 16 α 1 + k' 1 N = RS α k' 13

14 COMPONENTES FUNDMENTIS DE UM SISTEM DE GC COLUNS PR CROMTOGRFI GSOS Injector Detector Característica Tipo de coluna Capilar Enchimento (WCOT) Comprimento (m) Diâmetro interno (mm) Gás de arraste Gás de arraste Forno Coluna Tratamento de dados Eficiência (pratos/m) Quantidade de amostra (ng) Pressão relativa aixa lta Velocidade relativa Rápida Lenta INJECTOR DIRECTO Septo COLUN TUULR ERT ( ou COLUN CPILR) Seringa Coluna Purga do septo gulha da seringa Câmara de vaporização Gás de arraste 14

15 EFICIÊNCI DE COLUNS CPILRES E EMPCOTDS GSES DE RRSTE 10 6 N N 10 5 Capilares (WCOT) Empacotadas H (mm) He H (s) H (mm) Empacotadas Velocidade linear média (cm/s) 0.5 Capilares (WCOT) Velocidade linear média (cm/s) 15

16 DETECTOR DE IONIZÇÃO DE CHM Colector DETECTOR DE EMISSÃO TÓMIC ateria de díodos Rede de difracção 170 nm 50 nm ar 480 nm Chama ar-h Parede do forno ico de queima H Gás de complemento Coluna Plasma 656 nm 690 nm 748 nm 777 nm Coluna mostra duma gasolina DETECTOR DE CONDUTIVIDDE TÉRMIC Monitoração da linha do C Fluxo de saída Sinal do detector Monitoração da linha do O Fluxo de entrada (min) 16

17 COMPONENTES PRINCIPIS DE UM SISTEM DE HPLC SISTEM DE INJECÇÃO D MOSTR 1) Carregamento da amostra ) Injecção da amostra loop loop Unidade de injecção Solventes Coluna Detector Para a coluna Da bomba Saída Para a coluna Da bomba Saída DETECTOR DE UV PR HPLC Da coluna omba + sistema de gradiente Janelas de quartzo quisição e processamento de dados Fonte de UV Detector Para o esgoto 17

18 CROMTOGRFI LÍQUID Polaridades dos solutos: > > C EFEITO D ELUIÇÃO EM GRDIENTE Mistura de clorobenzenos Eluição isocrática 50:50 (v/v) MeOH/H O Eluição em gradiente Inicio: 40:60 (v/v) MeOH/H O MeOH 8%/min Fase normal Fase reversa Fase móvel de polaridade baixa Fase móvel de polaridade alta C C (min) (min) Fase móvel de polaridade média Fase móvel de polaridade média OM RECÍPROC PR HPLC Coluna C C Motor Junta selada mortecedor de pulsações Válvulas de esfera Pistão de vaivém Solvente 18

19 PLICÇÕES D CROMTOGRFI IÓNIC Eluente: NaHCO M / Na CO M Volume de amostra: 50 µl Eluente: Fenilenodiamina. HCl 0.05M / HCl 0.005M Volume de amostra: 100 µl 19

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