Métodos Físicos de Análise - CROMATOGRAFIA

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1 - CROMATOGRAFIA Prof. Dr. Leonardo Lucchetti Mestre e Doutor em Ciências Química de Produtos Naturais NPPN/UFRJ Depto. de Química de Produtos Naturais Farmanguinhos Fiocruz Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Fiocruz Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica Farmanguinhos Fiocruz

2 Conceito: Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases (estacionária e móvel) que estão em contato íntimo. Gás Fases móvel Líquido Fluido supercrítico estacionária Líquido Sólido

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5 A distribuição, exclusão, partição ou adsorção seletiva dos componentes é um processo de equilíbrio dinâmico: as moléculas dos analitos ora estão retidas na fase estacionária, ora estão deslocando-se com a fase móvel Quanto mais tenazmente uma substância interage com a fase estacionária, mais alta é a percentagem de moléculas que ficam retidas, o que provoca um retardamento em sua migração Quanto maior interação com a fase estacionária (fe), maior será o tempo de retenção (tr)

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7 Classificação quanto à natureza da fase móvel: (a) Cromatografia com fase gasosa (CG) fase móvel é um gás. (b) Cromatografia com fase líquida (CL) fase móvel é um líquido (c) Cromatografia com fluido supercrítico (CS) fase móvel é um fluido em estado supercrítico. Os processos de separação podem ocorrer por: - Adsorção - Partição - Exclusão - Complexação (troca de íons) - Bioafinidade

8 Classificação quanto a(o) Técnica/natureza Subtipo(s) Suporte da fase estacionária Natureza da fase móvel Planar Coluna Normal Reversa Camada fina Papel CG, CLAE, CS Fase estacionária polar Fase estacionária apolar Tipo de interação Objetivo da separação Adsorção Partição Exclusão Complexação (íons) Afinidade Analítica Preparativa Pré-tratamento

9 (a) Cromatografia planar (b) Cromatografia em Coluna Placa de vidro ou de alumínio Coluna cromatográfica empacotada c/ uma fase estacionária

10 Classificação quanto ao tipo de interação fm x fe (mecanismo de separação) Tipo de interação Adsorção Partição Exclusão Complexação (troca de íons) Afinidade (imunoafinidade) Afinidade (bioafinidade) Características Fase sólida contém adsorventes que promovem separação por interação eletrostática ou dipolar Fase sólida contém um líquido que promove absorção ou partição dos analitos. Mecanismo baseia-se na solubilidade dos componentes da amostra Fase sólida contém poros de dimensões determinadas que capturam moléculas menores e excluem maiores Fase sólida incorpora íons fixados a ela, os quais retêm contraíons. Íons da amostra presentes na fase móvel podem deslocar os contra-íons originais, fixando-se em seu lugar Fase sólida incorpora receptores elaborados por antígeno ou anticorpo, os quais retêm analitos que tenham afinidade por ela Fase sólida incorpora receptores elaborados por sistemas biológicos (enzimas, lecitinas), os quais retêm analitos que tenham afinidade por ela

11 Classificação Quanto ao Tipo de Interação fm x fe (mecanismo de separação) Interação das fases Tipo de interação Fase estacionária (exemplos) Adsorção Partição Sólido-Líquido ou Sólido-Gás Líquido-Líquido ou Líquido-Gás Sílica, Alumina RP18 e RP8 Exclusão Molecular Permeação em Gel Sephadex LH-20 Complexação Troca de Íons Resinas ligadas a cátions (NH 4+ ) ou ânions (SO 2-4 ) Afinidade Complexação Carbodiimida

12 Mecanismo de Interação: Adsorção O analito é adsorvido na interface da fm e fe. O fenômeno de retorno é chamado de dessorção. Os adsorventes possuem grupos ativos que promovem as atrações eletrostáticas ou dipolo-dipolo. Entre os adsorventes mais comuns estão a sílica e, em segundo lugar, a alumina (ácida, básica ou neutra)

13 Mecanismo de Interação: Adsorção As interações ocorrem nos sítios ativos da sílica: interação dipolodipolo e eletrostática. Grupos polares terão maior afinidade pelo sítios ativos da sílica e, por isso, ficaram retidos no leito cromatográfico. A sílica poderá ser inativada pela presença de água. Em fase reversa, os sítios ativos da sílica são ligados quimicamente a hidrocarbonetos (ex. RP8, RP18). Neste caso, alteram-se os mecanismos de interação (força de Van der Waals)

14 Mecanismo de Interação: Partição A fe é um líquido ligado a um suporte sólido e inerte ou nas paredes do tubo cromatográfico. O processo é intrafacial, ocorrendo por absorção ou partição. Baseiase nas diferenças de solubilidade dos componentes da amostra. A volta dos componentes à fase móvel depende da volatilidade (gáslíquido) ou da solubilidade nesta fase (líquido-líquido)

15 Mecanismo de Interação: Troca de íons Mecanismo de Interação: Troca de íons A fe é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis. Estão disponíveis trocadores aniônicos (retêm ânions) que têm sítios ativos carregados positivamente e trocadores catiônicos (retêm cátions) que têm sítios ativos carregados negativamente. A fm é uma solução iônica que deve ter a propriedade de substituir os íons que estão ligados à fe.

16 Mecanismo de Interação: Exclusão molecular (filtração em gel) Exemplo: purificação de polissacarídeos e proteínas. As substâncias de mesmo tamanho dos poros do gel são retidas, enquanto que as maiores serão eluídas. Com isso, tem-se uma separação baseada no tamanho molecular.

17 Mecanismo de Interação: Exclusão molecular (filtração em gel)

18 Mecanismo de Interação: Bioafinidade A fe entra em contato com a fm contendo o analito. Somente as substâncias com afinidade pelo ligante da fe sofrerão interação. 2- Os demais analitos serão eluídos com a fm. 3- Altera-se as propriedades da fm (ph) para que seja possível eluição da substância desejada. 4- A matriz é recuperada para ser usada novamente.

19 Propósitos da Cromatografia Separação Identificação Quantificação

20 Análise Qualitativa - Baseada na comparação de parâmetros de retenção - fator de retenção - tempo de retenção - Baseada na resposta da detecção - forma da mancha/pico - cor ou ausência de cor - reações - espectros - especificidade do detector

21 Análise Qualitativa Relação: concentração x área do sinal (pico) Normalização Padrão externo Padrão interno

22 - Todo componente produz um pico Análise Qualitativa Normalização - A resposta do detector é dependente apenas da concentração Calibração externa (padrão externo) - Solução contendo padrões de todas as substâncias a serem analisadas - Padrões em concentrações próximas à amostra - Condições analíticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeção Padronização interna - Uma substância conhecida é adicionada em concentração definida em todos os padrões e nas amostras; - Não co-elui com a amostra; - É estável e detectado na concentração em que se encontra. - Faz-se uma curva de calibração baseada na relação entre as áreas e concentrações do PI e da substância de interesse - Contamina-se a amostra com um volume conhecido da solução estoque do padrão interno (PI)

23 CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA (ou DELGADA)

24 (a) demonstração de um cromatograma em camada fina (b) determinação do fator de retenção (Rf)

25 Distância de Retenção e Fator de Retenção na cromatografia planar Parâmetros: dm (a) Distância total percorrida pelo solvente (dm); (b) Distância percorrida pela substância rosa ou distância de retenção (dr b); Assim: Rf = dr b / dm Exemplo: Se b percorrer 5 cm em um campo cromatográfico de 10 cm (dm); Rf = 5/10 = 0,5 (isso quer dizer que b ficou retido no meio da placa, ou 50%).

26 Adsorventes para ccf Silica gel Silica gel-f (indicator de fluorescência) Silicato de magnésio (Florisil) Poliamidas Amido Alumina

27 Adsorventes para ccf Silica Gel Polímero baseado em ligações silício-oxigênio com grupamentos hidroxila estendidos ao longo da matriz Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-Si-(OH)x Modo de separação: adsorção ou partição Regra das polaridades Ligações hidrogênio são a principal força que controla a adsorção dos grupos funcionais dos analitos

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29 Principais solventes para composição de fase móvel e ordem eluotrópica

30 Revelação de cromatogramas - olho nu (substâncias coloridas) - câmara de revelação (lâmpada) - 254nm - 365nm - reações cromogênicas - gerais (ex. iodo, H 2 SO 4, anisaldeído sulfúrico, NH 3, etc) - específicas (grupamentos funcionais) - ninhidrina - FeCl 3 - orcinol sulfúrico - etc

31 CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL (EM COLUNA) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE/HPLC) Cromatografia com fase gasosa (CG/GC ou CGAR/HRGC)

32 Termos técnicos e parâmetros para cromatografia em coluna Parâmetros: (a) Tempo de retenção = tr = tempo que a substância leva para ser eluída, a partir da injeção (b) Volume Morto = volume da coluna cromatográfica. Calculado com base no TR do metano (p/cg) (c) tr = tr tm = tempo de retenção ajustado (d) a = fator de separação = tr2 tr1

33 Termos técnicos e parâmetros para cromatografia em coluna Volume morto = volume da fase líquida/gasosa na coluna regra simplificada: volume morto = 65% do volume da coluna vazia e

34 Parâmetros de retenção

35 Seletividade = capacidade de um sistema diferenciar dois compostos (na CG é mais associada à coluna cromatográfica) Desejável: α maior que 1.2

36 Parâmetros de eficiência: pratos teóricos Pratos teóricos de uma coluna = representa as regiões de equilíbrio na coluna, como função das interações dos analitos entre a fm e a fe. Pode ser expresso por: Wh n = 16 (tr / Wb) 2 Pode ser obtido tb a partir da largura na metade do pico: n = 5,545 (tr / Wh) 2 Wb Vários fatores alteram o n, incluindo: condições de análise, tamanho da amostra, tipo de soluto e comprimento da coluna. Em tese, quanto maior for o comprimento da coluna, maior será a eficiência, em termos de pratos teóricos (mais regiões de equilíbrio). Para se comparar uma coluna com a outra, usa-se a altura equivalente a um prato teórico: h = L / n L = comprimento da coluna h= altura equivalente a um prato teórico

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38 Resolução

39 Resolução Medida de separação de dois picos consecutivos e traduz a eficiência da coluna e da fase estacionária. Distância entre dois sinais dividido pela média das larguras das respectivas bases: Rs = 2 (tr2 tr1) / Wb1 + Wb2 Deve-se, considerar, portanto, que o importante para a RESOLUÇÃO em cromatografia não é apenas a separação entre dois picos, mas também a largura desses picos.

40 Resolução

41 EXERCÍCIO A (1-3) B (5-6) C C (7-8) Resolução x Seletividade x Eficiência: A = B = C =

42 Cromatografia com fase gasosa (CG/GC ou CGAR/HRGC)

43 Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura através de uma fase gasosa móvel sobre um sorvente estacionário (líquido ou sólido). Foi dividida inicialmente em gás-líquido e gás-sólido. A partir da década de 80 surgiu a cromatografia com fase gasosa de alta resolução (CGAR) que emprega colunas capilares de alta resolução

44 Cromatografia com fase gasosa: tipos Cromatografia Gás-Sólido FE: sólidos (sílica, carvão grafitinizado, polímeros porosos) Princípio de retenção: adsorção, volatilidade Cromatografia Gás-Líquido Líquido mantido estacionário em suporte inerte Princípio de retenção: solubilidade, volatilidade

45 Cromatografia com fase gasosa: vantagens e desvantagens 1- Grande poder de resolução, o que possibilita a análise de amostras contendo até dezenas (ou centenas CGAR) de componentes; 2- Alta sensibilidade: dependendo do tipo de amostra e do detector empregado, é possível analisar amostras em concentração de picogramas (10-12 ). Geralmente em CGAR, injeta-se 1ml de amostra em concentração que varia de 10 a 1000 ppm; 3- Excelente técnica para análise quantitativa (desde picogramas até miligramas); 4- Técnica de análise relativamente rápida. 1- Só pode ser empregada em substâncias voláteis e estáveis termicamente. É possível a derivatização para se contornar este problema; 2- Não é conveniente para aplicação em cromatografia preparativa; 3- Não é muito eficiente como técnica analítica, uma vez que necessita de técnicas auxiliares, como acoplamento à espectrometria de massas.

46 Cromatografia com fase gasosa: gás de arraste (fase móvel) Características: (a) não deve interagir com a fe; (b) deve ser barato; (c) compatível com o tipo de detector. Gases mais usados: - Nitrogênio - Hélio - Hidrogênio - Argônio - Ar sintético (usado em conjunto com o detector de ionização em chama)

47 Cromatografia com fase gasosa: introdução da amostra - on-column - split/splitless - large volume - headspace

48 Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária Tipos de fases estacionárias (exemplos): - sólida: sílica, alumina, carvão ativado - líquida: DB-1, DB-50, OV-275. A fase estacionária pode ser polar, de polaridade intermediária ou apolar. Podem ser recheadas ou empacotadas (capilares); As colunas podem variar de 1m (recheadas) até 50m (capilares); Geralmente, a temperatura de análise não passa dos 350 o C em CGAR.

49 Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária Parâmetro Coluna empacotada Coluna capilar Diâmetro interno (mm) 1-4 0,15-0,75 Comprimento (m) Pratos teóricos Espessura da fase estacionária (µm) 5 0,5-2 Vazão do gás (ml/min) Volume da amostra (µl) ,001-0,5 Flexibilidade rígida flexível Fenômeno de separação adsorção partição Construção Camada porosa/convencional* PLOT/WCOT** Fase estacionária sólida líquida *carvão ativo, silica, peneiras moleculares, polímeros porosos ** porous layer open tubular / wall coated open tubular; silicones

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51 Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária Apolar: hidrocarbonetos não aromáticos, silicones (ex.: SE-30) Polar: contém grande quantidade de grupos polares (Ex.: Carbowax) - interações tipo pontes de hidrogênio Intermediária: grupos polares ou potencialmente polares em esqueleto apolar (ex. SE-52) Escolha da coluna: Polaridade da fase estacionária diâmetro e espessura do filme quantidade de amostras, tempo de análise, pressão (velocidade da FM), temperatura do forno Comprimento pratos teóricos

52 Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária Abreviação de algumas fases estacionárias DEGA - adipato de dietileno glicol DEGS - succinato de dietileno glicol SE-30 - metil silicone OV % fenil- metilsilicone Carbowax 20 M - polietilnoglicol

53 Cromatografia com fase gasosa: programação (gradiente) de temperatura

54 Polímeros estáveis e inertes Menos polares: polidimetilsiloxanas Silicones Substituição de metilas por outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil etc) gera fases estacionárias com polaridades crescentes Poliglicóis Polímeros de etileno glicol e epóxido, preparados com diferentes tamanhos da cadeia polimérica Moderadamente polares (álcoois, aldeídos, éteres etc) Carbowax (ex 20M = g/mol) Poliésteres Condensação de diácidos com glicóis Fases altamente polares Mais comuns: succinato e adipato de dietilenoglicol (DEGS e DEGA, respectivamente)

55 Cromatografia com fase gasosa: derivação (ou derivatização) A técnica não é adequada para análise de açúcares, aminoácidos e oligopeptídeos, por exemplo. Para que essas substâncias sejam analisadas por CG necessitam ser derivatizadas. Exemplos: AÇÚCARES (AcO) 2 O / piridina AÇÚCARES ACETILADOS ÁCIDOS CARBOXÍLICOS ÁLCOOIS BSTFA/piridina BF 3 /metanol ÉSTERES METÍLICOS ÉTERES METÍLICOS Alguns derivatizantes 1- Trimetilsilano (TMS) 2- Diazometano (H 2 C=N=N) 3- Anidrido acético / piridina 4- BF 3 / MeOH 5- BSTFA / piridina

56 Cromatografia com fase gasosa: detecção Em CG/EM usa-se 70 ev para gerar os íons que serão analisados. No caso de acoplamento do cromatógrafo com um espectrômetro de massas, o detector é o próprio espectrômetro. Os analitos deixam a coluna e entram na câmara de ionização, que está sob vácuo. As substâncias são ionizadas e os íons são identificados pelo espectrômetro, gerando um fragmentograma. Existem diferentes tipos de espectrômetros, sendo que os quadrupolos são os mais usados em CG/EM.

57 - seletividade: universais x específicos Cromatografia com fase gasosa: detecção - ruídos (problemas eletrônicos, impurezas, sujeiras nos gases/detector) - tipo de resposta (proporcionalidade à concentração do soluto ou à taxa de entrada de soluto no detector) - quantidade mínima detectável (gera sinais 2x mais intensos que o ruído) característica intrínseca do detector!) - fator de resposta: intensidade do sinal gerado por determinadas massas de soluto, que depende do detector e da substância analisada e pode ser visualizado como a inclinação da reta que correlaciona o sinal com a massa do soluto (curva de calibração); quanto maior o fator, mais confiável a análise quantitativa - faixa linear dinâmica = razão entre a menor e a maior massa entre as quais o fator de resposta de um detector para um soluto é constante, isto é, onde a curva de calibração é linear (mais significativos: TCD e FID)

58 Cromatografia com fase gasosa: detecção Captura de Elétrons (DCE) Bastante seletivo, respondendo bem para halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Pode ser empregado para análise de inseticidas clorados O nitrogênio com alto grau de pureza deve ser usado. Termoiônico (DPN) Seletivo para compostos contendo nitrogênio e fósforo

59 Cromatografia com fase gasosa: detecção Condutividade térmica (TCD ou DCT) A velocidade de perda de calor de um corpo quente para um frio é proporcional, dentre outros fatores, à condutividade térmica do gás que separa estes dois corpos. Quando um componente é eluído, ele sai misturado com o gás de arraste e passa pelo detector. Se a condutividade desta mistura for diferente da do gás de arraste puro, o filamento perde calor para o bloco numa taxa diferente daquela do equilíbrio. Detector universal e sensível à concentração de soluto no gás de arraste (H 2 ou He, gases de altíssimas condutividades térmicas assim, a mistura com o soluto sempre terá condutividade menor e, com isso, há a geração de sinais positivos e maiores fatores de resposta). Não é muito sensível (400pg/ml gás arraste) barato, simples e muito aplicado a análises que não requeiram alta sensibilidade Resposta universal, não destrói a amostra Fase móvel: hélio ou hidrogênio

60 Ionização em chama (FID ou DIC) Cromatografia com fase gasosa: detecção O funcionamento se baseia na condução de eletricidade pela chama originada pelos íons provenientes da queima de substâncias orgânicas. A chama de H 2 forma poucos íons (mau condutor elétrico) e quase nenhuma corrente passa pelos eletrodos a chama passa a conduzir corrente elétrica quando uma substância orgânica é queimada e gera íons. Esta corrente elétrica, amplificada, gera o sinal cromatográfico. Apenas substâncias não inflamáveis (CCl 4, H 2 O) ou algumas poucas que não formam íons em chamas (HCOOH) não dão sinal; de um modo geral, quanto mais ligações C-H a substância tiver, maior a resposta. Mais sensível que o TCD: 10 a 400pg. É o mais usado. Grande sensibilidade, resposta quase universal (não responde bem à agua) Sensível à concentração e destrutivo.

61 Cromatografia com fase gasosa: detecção

62 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE)

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64 workstation bombas para eluição em gradiente injetor coluna detector

65 Cromatografia líquida de alta eficiência: peculiaridades e características 1- Comumente chamada de cromatografia líquida de alta performance, alta pressão, alto desempenho; 2- Capacidade de realizar separações e realizar análises qualitativas/quantitativas de um grande número de substâncias, em poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade; 3- Permite a utilização de colunas com fase normal, reversa, com resinas de troca iônica e com polímeros que possibilitam exclusão molecular; 4- As colunas podem ser reaproveitadas; 5- Existem diversos tipos de detectores que podem ser usados em CLAE, os quais focam as propriedades do soluto ou deste dissolvido na fase móvel; 6- O uso de bombas pneumáticas permite a aplicação de gradientes de solventes, ou seja, mudanças na composição da fase móvel ao longo da corrida cromatográfica; 7- As bombas usadas em CLAE permitem fluxo constante, o que garante maior eficiência de separação e, consequentemente, maior resolução. 8- A amostra deve ser solúvel na fase móvel

66 Cromatografia líquida de alta eficiência: principais componentes sistema de injeção bomba coluna detector amostra solventes

67 Cromatografia líquida de alta eficiência: principais componentes

68 Cromatografia líquida de alta eficiência: principais componentes

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72 Cromatografia líquida de alta eficiência: mecanismos de interação 1- Adsorção Fase estacionária é um sólido (cromatografia líquido-sólido) As condições de análise podem ser preestabelecidas por ccd, usando sílica gel. Ex. colunas com sílica e alumina. Solventes usados: os mesmos empregados para ccd, como hexano, clorofórmio, acetato de etila, metanol e misturas destes. Usos: ácidos graxos, álcoois, barbitúricos, corantes, esteróides. 2- Partição Fase estacionária é um líquido (cromatografia líquido-líquido) A fase estacionária não está quimicamente ligada à superfície de um suporte. Ex. coluna empacotada com sílica, com adição de água e clorofórmio como fase móvel. A separação se dará pela partição das substâncias entre a fase aquosa e a orgânica. 3- Exclusão Molecular Fase estacionária é uma resina ou sílica com tamanho de partícula controlada cromatografia de exclusão. Efetua a separação de acordo com o tamanho efetivo das moléculas. As moléculas maiores movem-se rapidamente, enquanto que as menores (considerando-se o tamanho dos poros) movem-se mais lentamente com a fase móvel. 4- Troca Iônica Fase estacionária é uma resina ligada a grupos iônicos (ânions ou cátions) cromatografia por troca iônica. Usos: análise de ácidos carboxílicos, analgésicos, ânions inorgânicos e cátions metálicos.

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75 Cromatografia líquida de alta eficiência: fase estacionária Polar (fase normal ): Silica, alumina Terminações ciano, amino ou diol na fase ligada Não-polar ( fase reversa ) Normalmente terminações C18 e C8 na fase ligada Terminações fenil e ciano na fase ligada Misturas de grupos funcionais podem ser usadas

76 Cromatografia líquida de alta eficiência: fase estacionária

77 Cromatografia líquida de alta eficiência: mecanismo (simplificado) Interações não polares (não específicas) do analito com a superfície hidrofóbica adsorvente (-C18, C8, fenil etc) Diferença na afinidade de sorção do analito resulta em separação Analitos mais polares ficam menos retidos Analitos com partes hidrofóbicas maiores ficam mais retidos Isômeros estruturais praticamente não se separam

78 Cromatografia líquida de alta eficiência: efeito da composição da fm na seletividade % MeCN % MeCN % MeCN % MeCN

79 Cromatografia líquida de alta eficiência: otimização da polaridade da fm

80 Cromatografia líquida de alta eficiência: fase móvel 1- Ter alto grau de pureza (grau HPLC); 2- Dissolver a amostra sem decompor seus componentes ou a fase estacionária; 3- Ter baixa viscosidade (para não aumentar a pressão do sistema); 4- Ser compatível com o tipo de detector usado; 5- Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra.

81 Cromatografia líquida de alta eficiência: detectores 1 Alta sensibilidade e baixo limite de detecção 2 Resposta rápida 3 Insensibilidade às mudanças de temperatura e vazão de fase móvel 4 Resposta independente da composição da fase móvel e proporcional em relação à concentração dos analitos Infelizmente, não existe um só tipo de detector tão versátil. Os aparelhos modernos podem trabalhar com mais de um tipo de detector ao mesmo tempo.

82 Cromatografia líquida de alta eficiência: detectores 1- Espectrofotometria no UV-VIS absorbância na faixa do UV-VIS (limite = 2 x ) 2- Fluorescência excitação com luz produz uma fluorescência (limite = ) 3- Índice de refração mudanças no IR da fase móvel (limite = 10-7 ) 4- Eletroquímico oxidação ou redução em potencial fixo (limite = ) 5- Condutividade elétrica condutividade elétrica em razão da presença de íons (limite = 10-8 ) 6- Espectrometria de massas analisa os fragmentos obtidos após ionização; usado para análise qualitativa; empregado em conjunto com o UV-vis (quantitativa).

83 Cromatografia líquida de alta eficiência: detectores

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86 Cromatografia líquida de alta eficiência: eluição em gradiente

87 Cromatografia líquida de alta eficiência: influências 1 Que afetam a eficiência: Fluxo Comprimento da coluna Diâmetro da partícula Distribuição de tamanho de partícula 2 Que afetam a retenção: Tipo de eluente Composição do eluente Tipo de fase estacionária Natureza do analito 3 Que afetam a seletividade: Tipo de fase estacionária Natureza do analito Aditivos no eluente Temperature Composição do eluente (analitos ionizáveis)

88 COMPARAÇÃO: CG X CLAE Fator CG CLAE Requisitos para Amostra Tipo de Amostra Amostra ou derivado volátil, termicamente estável na temperatura do sistema Gases, líquidos e sólidos. PM de 2 a 1200 Amostra solúvel na fase móvel. Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes. PM de 32 a Limite de Detecção (DIC ou DCE) 10-9 (UV-VIS) Pratos Teóricos / Coluna Capacidade Preparativa Pobre até razoável Boa, com facilidade de coleta e automação Capacidade Analítica Excelente. Até 200 componentes Excelente. Até 50 componentes.

89 QUESTÕES DE CONCURSOS 1- A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. Neste contexto, assinale a alternativa que indica o adsorvente seguramente mais utilizado em CCD nos laboratórios. (Perito Criminal PC/ PE 2006 IPAD) A) Celulose. B) Sílica. C) Alumina. D) Poliamida. E) Silicato de cálcio. 2- Julgue CERTO OU ERRADO. (Pesquisador Inmetro 2007 CESPE/ UnB). A cromatografia é um método de separação dos componentes de uma mistura. No entanto, não pode ser usado para misturas complexas, pois apresenta restrições na separação de componentes muito semelhantes.

90 QUESTÕES DE CONCURSOS 3- Julgue CERTO OU ERRADO. (Pesquisador Inmetro 2007 CESPE/ UnB). A classificação dos métodos apóia-se nos tipos de fases móvel e estacionária. A fase estacionária pode ser sólida ou líquida; nesse último caso, o líquido é adsorvido ou ligado ao sólido. A fase móvel, por sua vez, pode ser líquida, gasosa ou um fluido supercrítico. 4- Na cromatografia gasosa de partição, as interações que ocorrem entre as moléculas dos diferentes componentes da mistura a analisar e a fase estacionária líquida são devidas, principalmente, a forças de atração de Van der Waals e a ligações de hidrogênio.

91 QUESTÕES DE CONCURSOS PERITO CRIMINAL NÍVEL SUPERIOR SSP/PB

92 QUESTÕES DE CONCURSOS PERITO CRIMINAL NÍVEL SUPERIOR SSP/PE

93 QUESTÕES DE CONCURSOS PERITO CRIMINAL NÍVEL SUPERIOR SSP/PE

94 QUESTÕES DE CONCURSOS 57 - A separação entre dois picos em um cromatograma é definida pela sua resolução RS, calculada como sendo: a) igual ao fator de separação a. b) a razão entre o valor médio das bases dos dois picos pela distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos. c) a razão entre a distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos pelo valor médio da largura das bases dos dois picos. d) a média das alturas dos picos, dividida pelo fator de separação a. e) a razão entre a distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos e o fator de separação a. PERITO SSP/PR ENG.QUÍMICA

95 QUESTÕES DE CONCURSOS PERITO SSP/PR ENG.QUÍMICA

96 QUESTÕES DE CONCURSOS 48. Sobre a cromatografia, marque a opção verdadeira: A) A cromatografia pode ser classificada de acordo com os mecanismos de separação física em cromatografia de adsorção e de partição. A de adsorção baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra. B) Na Cromatografia em Camada Delgada a análise qualitativa de uma substância realiza-se através de seu Rf que se determina pela relação entre a distância percorrida pela fase móvel dividida pela distância percorrida pela substância. C) A fase móvel é selecionada em função de suas polaridades; logo em ordem crescente de polaridade podemos citar: éter de petróleo, clorofórmio, acetona, metanol e água. D) O processo de separação da Cromatografia em Camada Delgada está fundamentado no fenômeno de partição (PERITO LEGISTA, SSP-CE, 2003)

97 QUESTÕES DE CONCURSOS 49. Sobre a cromatografia gasosa, marque a opção verdadeira: A) A cromatografia gasosa é utilizada na separação de substâncias volatilizáveis, uma vez que se usam temperaturas convenientes no local de injeção da amostra e na coluna, possibilitando a vaporização dessas substâncias. B) A fase estacionária na cromatografia gasosa é um gás. E os gases mais usados são: nitrogênio, hélio, hidrogênio e argônio. C) O Detector de captura de elétrons utilizado na Cromatografia Gasosa é seletivo para compostos contendo fósforo e nitrogênio como os inseticidas fosforados e nitrogenados. D) O Detector por ionização em Chama tem uma baixa sensibilidade, sendo utilizados para identificação de compostos com halogênios como os inseticidas clorados. (PERITO LEGISTA, SSP-CE, 2003)

98 QUESTÕES DE CONCURSOS 55 - Em uma separação cromatográfica existe a fase móvel e a fase estacionária. A fase móvel é um solvente que fica armazenado e necessita de tratamento preliminar para seu emprego. Esse tratamento preliminar consiste em degaseificar o solvente para: 1. evitar a formação de bolhas de gás quando a fase móvel é despressurizada. 2. garantir a alta sensibilidade do resultado obtido por detectores ultravioleta, uma vez que o oxigênio dissolvido absorve na região do UV entre 190 e 260 nm, alterando o resultado. 3. evitar ruído quando são empregados eletrodos eletroquímicos. 4. evitar interferências na adsorção das substâncias que estão sendo separadas na coluna. Assinale a alternativa correta. a) As afirmativas 1, 2, 3 e 4 são verdadeiras. b) Somente as afirmativas 1 e 2 são verdadeiras. c) Somente as afirmativas 3 e 4 são verdadeiras. d) Somente as afirmativas 1, 2 e 3 são verdadeiras. e) Somente as afirmativas 1, 2 e 4 são verdadeiras Quanto ao emprego de detectores de fluorescência em cromatografia, a fase móvel interfere na emissão de fluorescência, quando apresenta características inadequadas. Assinale a alternativa que apresenta as propriedades a serem analisadas para seleção da fase móvel. a) Constante dielétrica, ph, temperatura, concentração da fase móvel, viscosidade. b) Fotodecomposição, ph, temperatura, concentração. c) Viscosidade, densidade, ph, potencial de oxi-redução. d) Constante dielétrica, viscosidade e fotodecomposição. e) Densidade e constante dielétrica. PERITO SSP/PR ENG.QUÍMICA

99 QUESTÕES DE CONCURSOS PF Farmácia 2004

100 QUESTÕES DE CONCURSOS A análise qualitativa de uma substância por cromatografia em camada delgada, realiza-se através do seu Rf (razão entre a distância percorrida pela substância e a distância percorrida pela frente da fase móvel). Esse parâmetro está relacionado com outro parâmetro nas cromatografias líquida e gasosa que é: a) a altura do pico; b) o tempo de retenção; c) a razão entre área da substância e área do padrão interno; d) a velocidade linear do gás de arraste; e) a relação sinal/ruído. (PERITO LEGISTA TOXICOLOGIA PF)

101 QUESTÕES DE CONCURSOS 35 - Com relação à cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), assinale a alternativa correta. a) As técnicas de cromatografia em HPLC separam apenas peptídeos. b) Na HPLC, um solvente líquido, com uma mistura de moléculas a serem identificadas, é passado por uma coluna contendo resina ligada a compostos de alta afinidade. c) Na HPLC, as esferas de resina podem ser recobertas por grupos carregados para separar compostos por troca iônica. d) Em HPLC, são usados tubos de plástico ou vidro para realizar o empacotamento da resina. e) As separações de HPLC têm resolução alta e reprodutibilidade baixa. (PERITO FARMÁCIA E BIOQUÍMICA SSP/PR 2007)

102 QUESTÕES DE CONCURSOS A cromatografia em camada delgada é a técnica de triagem mais utilizada em todos os laboratórios de toxicologia forense. Esta técnica permite a manipulação de variáveis importantes para detecção de compostos isolados da matriz orgânica. Entre essas variáveis podemos enunciar: a) eluente, índice de refluxo e revelador; b) adsorvente, índice de refluxo e agente cromogênico; c) adsorvente, eluente e agente cromogênico; d) adsorvente, eluente e gás carreador; e) pressão de vapor e temperatura do eluente. A cromatografia gasosa é uma técnica de separação que desde os anos 70 vem sendo cada vez mais utilizada na área da toxicologia forense. Entretanto, como toda técnica, ela tem limitações quanto ao seu emprego na fase de triagem. A princípio, para ser passível de análise por cromatografia gasosa, uma substância precisa: a) se degradar nas temperaturas do injetor; b) se volatilizar nas temperaturas operacionais; c) não conter nitrogênio na estrutura química; d) não interagir com a fase estacionária; e) ser volátil e estável à temperatura ambiente. A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas empregadas nas análises toxicológicas. Indique a alternativa que NÃO se apresenta como vantagem na aquisição desse equipamento: a) a boa sensibilidade; b) a versatilidade; c) a alta resolução; d) os resultados qualitativos; e) o baixo custo de aquisição do equipamento. (PERITO LEGISTA TOXICOLOGIA PF)