CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ANÁLISE DA CAFEÍNA EM BEBIDAS POR HPLC

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1 1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ANÁLISE DA CAFEÍNA EM BEBIDAS POR HPLC 1 - OBJECTIVO Pretende-se ilustrar a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (H.P.L.C.) aplicando-a na determinação de cafeína em algumas bebidas. 2 - INTRODUÇÃO Tem-se verificado um grande incremento nos métodos de cromatografia liquida, tendose vulgarizado a utilização de aparelhos para realização de cromatografia líquida de alta eficiência cuja constituição básica pode ser representada esquematicamente como se apresenta na figura 1. A abreviatura H.P.L.C. deriva da designação inglesa High Performance Liquid Chromatography. Nesta técnica o eluente é alimentado através de uma (ou mais) bomba(s), que assegura(m) a passagem de um caudal controlado do eluente ao longo dos diversos componentes do sistema cromatográfico. Figura 1 - Representação esquemática de um cromatógrafo líquido para HPLC.

2 2 A amostra é colocada no loop da válvula de injecção por meio de uma seringa (ver figura 2), quando esta está em posição de carga (posição: load). Rodando o manípulo da válvula para a posição de injecção (posição: inject), dá-se uma alteração no trajecto do eluente no interior desta e a amostra é então arrastada para a coluna. O eluente, que é continuamente bombeado para a coluna, vai arrastar os componentes da amostra (designados vulgarmente por solutos) primeiro para o topo e depois ao longo da coluna. Figura 2 - Representação esquemática da válvula de injecção e do processo de introdução de amostras na coluna de HPLC. (A) Introdução da amostra no loop da válvula, (B) Introdução da amostra na coluna. Se os solutos tiverem alguma afinidade pela fase estacionária da coluna, ao longo desta vão-se estabelecer sucessivos equilíbrios de distribuição dos solutos entre a fase móvel (o eluente) e a estacionária. Se as constantes de distribuição para os diversos solutos forem suficientemente diferentes, estes irão deslocar-se ao longo da coluna a velocidades diferentes, saindo da coluna separados uns dos outros. Em seguida os componentes da amostra passam a um detector, que neste trabalho consiste num espectrofotómetro de UV/Vis com uma célula de fluxo especialmente desenhada para permitir a medida da absorvância da solução que nela passa sem que se dê alargamento significativo da zona de líquido onde está cada um dos solutos. Um registador, que está ligado ao detector, permite obter automaticamente o sinal enviado por este o qual, em primeira aproximação, é proporcional à concentração do

3 3 componente na solução que passa nesse instante através da célula do detector. A representação gráfica do sinal enviado pelo detector em função do tempo que decorreu desde a injecção da amostra na coluna constitui o que se designa por cromatograma da mistura. Sendo conhecido o caudal de eluente, se necessário pode transformar-se a escala de tempos em volumes de efluente. Figura 3 - Cromatograma como representação gráfica do sinal registado pelo detector (proporcional à concentração dos solutos) em função do tempo. As colunas de enchimento utilizadas em HPLC são vulgarmente de aço inoxidável e contêm um enchimento com partículas de diâmetro entre 3 e 20 µm. Como regra geral, quanto mais pequenas são as partículas do enchimento, mais eficientes são as colunas. No entanto quanto mais pequenas são as partículas, maior é a perda de pressão do líquido ao longo da coluna e menor é o caudal de eluente para a mesma pressão aplicada. Como há limitações instrumentais à utilização de pressões muito elevadas, quanto menor for o diâmetro das partículas do enchimento, menor é também o comprimento da coluna que se utiliza. As colunas analíticas usuais têm de 3 a 30 cm de comprimento e de 2 a 5 mm de diâmetro interno.

4 4 Como consequência do empacotamento das partículas de pequena dimensão no interior da coluna, são necessárias pressões elevadas para forçar o eluente ao longo da coluna, sendo usual utilizarem-se pressões entre 80 e 120 bar. A bomba tem de manter um caudal de eluente constante, sem oscilações de pressão ou caudal e tem de ser construída com material compatível com uma larga gama de solventes. Embora se possam utilizar pressões de bar, não é aconselhável o uso em rotina de pressões tão elevadas. Os solventes utilizados em HPLC têm se ser muito puros e não podem conter resíduos sólidos. Devem ser desgaseificados antes da sua utilização, pois a formação de bolhas de gás no sistema cromatográfico pode causar variações de pressão no interior do sistema e/ou perturbações mais ou menos graves no sinal do detector. A desgaseificação pode fazer-se submetendo o eluente a pressões reduzidas e/ou ultra-sons, ou por deslocamento dos gases dissolvidos com hélio (este é o sistema indicado na figura 1). A eluição pode ser feita mantendo sempre o mesmo eluente (eluição isocrática), ou variando a composição do eluente com o tempo (eluição com gradiantes). Sempre que possível deve proceder-se a uma eluição isocrática. A cafeína é um alcaloide e uma purina. É um produto estimulante e diurético conhecido pela sua existência no café, no chá, em bebidas da família das colas e em produtos farmacêuticos. O seu doseamento por este método é bastante rápido e de aplicação simples. 3 - PARTE EXPERIMENTAL Aparelhagem O cromatógrafo tem os seguintes componentes principais:

5 5 Reservatório de eluente Bomba Válvula de injecção Pré-coluna Coluna de mm (Merck, Lichrosphere RP-18) Detector de ultravioleta, λ = 225 nm Registador/integrador. 3.2 Reagentes, etc. Cafeína; metanol para cromatografia; ácido perclórico (solução 1:99); água destilada; filtros para injecção de amostra de 0.2 µm de malha (ex. ANATOP 10 ou 25) Soluções a preparar Preparar as seguintes soluções em balões volumétricos, pesando rigorosamente os sólidos: - solução de cafeína 1 (0.01 g em 1000 ml) - solução de cafeína 2 (0.02 g em 1000 ml) - solução de cafeína 3 (0.015 g em 500 ml) - solução de cafeína 4 (0.02 g em 500 ml) - solução de cafeína 5 (0.025 g em 500 ml) - solução de cafeína 6 (0.03 g em 500 ml) - solução de cafeína 7 (0.037 g em 500 ml) - solução de ácido benzoico padrão interno (0.015g em 1000 ml) - solução de café solúvel descafeinado (0.5 g em 100 ml) - solução de café solúvel (0.1 g em 100 ml) Para as soluções de café, em primeiro lugar pesa-se rigorosamente cada um dos sólidos e dissolvem-se em copos de ~50 ml. Depois da dissolução o líquido é transferido para um balão volumétrico de 100 ml e estes são preenchidos com água destilada até ao traço. Depois de homogeneizar a solução esta deve ser filtrada num filtro de pregas. A amostra de cola deve ser desgaseificada em vácuo à trompa. Preparar o eluente a utilizar misturando 500 ml de metanol (grau HPLC) com 500 ml de uma solução aquosa contendo de ácido perclórico (1:99). Filtrar o eluente com a montagem apropriada para esse efeito.

6 Condições experimentais Caudal de eluente: entre 1.0 e 1.5 ml/min, desde que a pressão seja inferior a bar. Velocidade do papel do registador: 0.5 (ou 2.0 num dos cromatogramas) cm/min Atenuação no registador: entre 2 e 32 Comprimento de onda de detecção: 225 nm Técnica Para fazer as injecções das soluções: a) Cada um dos padrões e cada uma das amostras (soluções dos cafés e da cola) devem ser misturados com volumes iguais da solução de ácido benzoico, por ex. para copos de 50 ml pipetar 10.0 ml de cada e misturar com 10.0 ml da solução de ácido benzoico (também com pipeta), b) Lavar a seringa com água destilada e várias vezes com a solução que vai ensaiar, c) Em seguida, com a válvula em posição de load, faça passar cerca de 2 ml da solução por duas vezes nos tubos da válvula, tendo o cuidado de não introduzir ar quando pressiona o êmbolo da seringa. Não retirar a seringa após a 2ª introdução de solução a analisar, d) Para introduzir a amostra na coluna rodar a válvula de injecção da posição de load para a posição de inject. Simultaneamente iniciar o registo do cromatograma no registador/integrador (carregar em INJECT A). Pode agora retirar a seringa da válvula. e) Depois de terminar o registo da banda da cafeína, parar o registo do cromatograma carregando novamente em INJECT A no registador/integrador. Proceder à injecção dos padrões de cafeína 1 a 7 (contendo a mesma concentração de ác. benzoico). Para a análise das amostras, repita b) a e), mas agora com cada uma das soluções de café e da cola (todas contendo a mesma concentração de ác. benzoico). As amostras devem ser injectadas na válvula através de um filtro especial (em forma de disco), que lhe será fornecido pelo professor. Deve verificar se a recta de calibração tem a forma adequada e se as áreas das bandas da cafeína obtidas para as amostras são tais que a determinação da concentração de cafeína pode ser feita por interpolação com os valores disponíveis para os padrões (excepto para o café descafeinado). Se isso não suceder deverá preparar e injectar novos padrões de cafeína de forma a que a quantificação possa ser feita correctamente. 4 - CÁLCULOS

7 7 1) Trace a recta de calibração para a cafeína: razão das áreas das bandas (A cafeína / A benzoico ) em função da concentração da cafeína. 2) Calcule a(s) concentração(ões) de cafeína na(s) amostra(s) que analisou. Tome atenção para verificar se as áreas das bandas determinadas pelo integrador estão compatíveis com o aspecto dos picos correspondentes. Determinar os teores de cafeína nas amostras. 3) Determine o número de pratos da coluna (N) e a altura equivalente a um prato (H), tomando um ou mais dos cromatogramas como referência. 4) Preencher a folha de resultados. 5 - QUESTIONÁRIO 1) Qual a vantagem em utilizar uma coluna do tipo da LiChrosorb RP-18 na análise efectuada? Qual o mecanismo de separação neste tipo de cromatografia? 2) Comente a separação obtida e a ordem de aparecimento dos componentes. 3) Tem alguma sugestão no sentido de melhorar a separação nas análises de cafeína nos cafés? Justifique. 6 - BIBLIOGRAFIA 1) S. Lindsay, High Performance Liquid Chromatography, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, ) G.W. Ewing, Instrumental Methods of Chemical Analysis, McGraw-Hill Book Co., New York, 5ª ed., 1985, p ) D.A. Skoog e J.J. Leary, Principles of Instrumental Analysis, Saunders Coll. Publ., 4ª ed., Fort Worth, 1992, p ) D.A. Skoog, D.M. West e F. J. Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, 6ª ed., Saunders Co. Publ., Fort Worth, 1992, p ) H. Willard, L.L. Merrit, Jr., J.A. Dean e F.A. Settle, Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth Publ. Co., Belmont, 1988, p. 580.

8 8 Na biblioteca do DEQB está disponível a revista LC-GC Europe, que tem diversos artigos com interesse em HPLC de carácter didáctico.

9 9 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência I - Análise da cafeína em bebidas por HPLC FOLHA DE RESULTADOS Dia da semana (da turma) Nomes Grupo nº Data / / Números Características da coluna utilizada Comprimento cm Marca e refª Diâmetro interno mm Fase estacionária Parâmetros de operação Caudal ml min 1 Temperatura ºC Atenuação no registador Pressão média bar Comprimento de onda nm Velocidade do papel cm min 1 Eficiência da coluna (para um ou mais dos cromatogramas): Cafeína Tempo de retenção Largura de banda Número de pratos HETP : mm Ác. Benzoico Tempo de retenção Largura de banda Número de pratos HETP : mm Resolução entre a cafeína e o ác. Benzoico

10 10 Resultados para os padrões de cafeína Padrões Concentrações Áreas Observações (g/l) Cafeína 1 Cafeína 2 Cafeína 3 Cafeína 4 Cafeína 5 Cafeína 6 Cafeína 7 Anexar a curva de calibração e cromatogramas. Amostras ensaiadas Amostra Área da Banda Concentração de cafeína Observações na solução injectada Cola Café solúvel Café descafeinado Teores de cafeína nas amostras Cola mg / litro Café solúvel % peso Café descafeinado % peso

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