Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Thin Layer Chromatography (TLC)

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1 Material disponível no site Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Thin Layer Chromatography (TLC) Prof. Renato Zanella (UFSM) A cromatografia em camada delgada é outra forma de cromatografia onde o material adsorvente fica sobre um vidro, alumínio ou filme plástico. A separação pode ser convenientemente expressa como um fator de retardo ou fator de retenção (Rf), definido como: Rf A = da/ds e Rf B = db/ds 0 Rf 1

2 2 - Rf difícil de reproduzir pois depende de: natureza e granulometria do adsorvente natureza do eluente, grau de ativação, técnica do operador, T e quantidade amostra. - Câmaras de eluição (tanque, sandwich, HPTLC); Preparo das placas - Avaliação qualitativa, Avaliação semi-quantitativa O exemplo de cromatografia mais clássico é a cromatografia em papel onde uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. O papel é composto por moléculas extremamente longas chamadas celulose. A celulose é um polímero polar com muitas regiões de altas e baixas densidades de elétrons. A cromatografia em papel é uma das técnicas mais simples e que requerem menos instrumentos para realização, porém também apresenta as maiores restrições para realização em termos analíticos.

3 Aplicação 3 ou Eluição Resultado Exemplos de aplicação: Cromatograma de 10 óleos essenciais. Placa revelada com vanilina.

4 4 CCD de clorofila Pigmentos utilizados em tinta de marcador preto (A), amarelo (B) e vermelho (D) são os mesmos. Vamos investigar se a tinta do marcador verde (C) é um corante só ou uma combinação. CCD Bidimensional (Eluição efetuada em duas direções com solventes diferentes)

5 Revelação empregando derivatização pós-cromatográfica Se as substâncias na placa não forem ativas em UV, a absorbância ou fluorescência pode ser gerada pela imersão ou spray de reagentes adequados, chamados reveladores. Imersão para derivatização é indicada para: Aumentar a reprodutibilidade em determinações quantitativas Aumentar a proteção ambiental/higiene industrial Evitar contaminação do ambiente de trabalho 5 Revelação

6 Contraceptivos 6 1 = cholesterol 4 = estriol 7* = contraceptive 2 10 = alpha norgestrel 2 = beta-estradiol 5 = diethyl stilbestrol 8 = progesterone 11 = cortisol 3 = estrone 6* = contraceptive 1 9 = norethindrone Rf values contraceptive , 0.25, 0.03 contraceptive , 0.35, 0.2, 0.02 cholesterol 0.75 beta-estradiol 0.25 estrone 0.5 estriol 0.05 diethyl stilbestrol 0.24 progesterone 0 norethindrone 0.4 alpha-norgestrel 0.6 Based on a comparison of Rf values and colorimetric identification, I deduce that both unknown contraceptives contain norethindrone and beta-estradiol. Unfortunately, the progesterone, estriol, and cortisol standards did not give very clear marks on the silica gel paper. cortisol 0

7 Cromatografia de aminoácidos em papel 7 Na cromatografia em papel, por exemplo, a resolução de uma mistura de solutos sobre um papel de filtro pode depender de uma variedade de fenômenos, tais como adsorção à superfície do papel, troca iônica ou na partição entre solventes. Os aminoácidos podem ser separados por cromatografia em papel devido a sua solubilidade que os diferentes tipos desta substância apresentam pela água de hidratação ao redor das fibras de celulose e pela fase orgânica móvel que flui através destas fibras. A solubilidade relativa dos aminoácidos nestas duas fases pode ser mudada por alterações na polaridade do solvente, ou no ph da solução, o qual irá alterar o estado iônico dos aminoácidos. Sob um conjunto adequado de condições, então, cada molécula de uma mistura irá se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionária e estará a uma distância específica de um do ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Os aminoácidos não absorverem luz no comprimento de onda visível, assim a reação de ninhidrina é usada para este propósito por que reage com grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente púrpura). Diversos aminoácidos, contudo, produzem diversas tonalidades de cores com a ninhindrina, o que pode ajudar em sua identificação. A reação da ninhindrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a reação com a tirosina produz uma coloração azul metálica.

8 8 CROMATOGRAFIA de ADSORÇÃO...fenómeno de superfície que ocorre na interfase, implicando interacções dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de hidrogénio, complexos p FE: Adsorvente FM: Eluente Sílica: silanol SiO2.xH2O; Alumina: Al3+, 02- Influenciada por: Natureza da FE Solubilidade substâncias FM Capacidade adsorção na FE para cada substância FE Inorgânicas: Sílica Alumina ácida, básica ou neutra FE Orgânicas: Celulose Poliamidas Sephadex Florisil

9 Poder adsorvente das fases estacionárias 9 Poder adsorvente da silica (maior afinidade = maior retenção = menor Rf) Polaridade dos solventes

10 10 Efeito de Bordo = Saturação da Câmara Deficiente ou Excesso de amostra HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography Instrumental TLC usada para descrever uma técnica moderna, instrumental e de alta performance, onde a avaliação é feita através de equipamentos e software

11 Princípio do Método 11 Separação de misturas de compostos moleculares através da migração diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (ou estacionária) e outra móvel, que desliza sobre a primeira. Ou também pode ser expresso como um procedimento de separação microanalítico no qual os componentes de uma mistura são transportados para diferentes distâncias em uma placa recoberta com uma fina camada de material poroso. A espessura da camada pode variar de 100 a 250 mm. A placa que serve de suporte em geral é de vidro, mas pode ser de plástico ou de alumínio. A camada que recobre a placa recebe o nome de fase estacionária e em geral é constituída de sílica gel. O mecanismo de transporte é um solvente e é conhecido como fase móvel. Primeiro a amostra é dissolvida em um solvente adequado, então, uma certa alíquota desta solução é aplicada na região de partida e o conjunto é seco. A placa de TLC/HLTPC é então colocada em uma câmara de desenvolvimento ou cuba, o qual contém o solvente. Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento cromatográfico onde os componentes da amostra são influenciados pela ação de duas forças, opostas entre si: Capilaridade: é a responsável pelo avanço do solvente ou fase móvel sobre a fase estacionária que contém a amostra. Interação: tão logo se inicia a migração da fase móvel, a amostra é dissolvida e começa a ser arrastada pela fase móvel. Neste momento aparecem forças de interação entre os componentes da amostra e a fase estacionária. Estas forças de interação se opõem à força de arraste da fase

12 móvel (capilaridade) retardando o avanço dos componentes da amostra. Este retardo não ocorre da mesma forma para os diversos constituintes presentes na amostra aplicada. Forças de interação como dipolo induzido, pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals tomam parte neste processo, fazendo ocorrer mecanismos de separação como adsorção, dispersão e troca iônica. 12 Diferenças entre Placas de TLC e HPTLC Placas comercialmente já preparadas são mais indicadas pois garantem boa reprodutibilidade, devido à homogeneidade da aplicação da fase estacionária no suporte. Na tabela abaixo estão as diferenças entre as placas TLC e HPTLC Tamanho médio de partículas TLC HPTLC µm 5 7 µm Distribuição de partículas Larga Estreita Espessura da placa 250 µm 100, 200 µm Número máximo de amostras Distância de migração mm mm Tempo de migração min 3 20 min Quantidade de solvente 50 ml 5 10 ml Limite de detecção Abs ng Fluor ng Abs ng Fluor 0,1 10 ng

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