6/16/2014 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRAFIA. Tipos de Métodos de Separação
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- Yan Casqueira Amarante
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1 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRAFIA Prof. Wendell Coltro Tipos de Métodos de Separação 1) CLÁSSICOS: precipitação, destilação e extração - Tiveram uso intenso até a metade do século XX; - Técnicas úteis para amostras com poucos componentes (em altas concentrações) e relativamente puras; - Porém são pouco seletivas e apresentam baixa sensibilidade. 2) INSTRUMENTAIS: cromatografia e eletroforese - Técnicas imbatíveis na separação de amostras multicomponentes; - Apresentam alta seletividade e sensibilidade; - Sistema integrado (análise é feita de modo completo). 1
2 Introdução a Métodos Cromatográficos CROMATOGRAFIA (Definição): técnica analítica (clássica ou instrumental) que permite a separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). A Cromatografia foi inventada (e assim denominada) no início do século 20 (1903) pelo botânico russo Mikhail Tswett. Ele empregou a técnica para separar vários pigmentos de plantas (como a clorofila e a xantofila) passando soluções desses componentes através de uma coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (CaCO 3 ). As espécies separadas apareciam como bandas coloridas na coluna, daí originando o nome da técnica: CROMATOGRAFIA: do grego CHROMA (COR) + GRAPHEIN (ESCREVER) EXPERIMENTO DE TSWETT PRINCÍPIO BÁSICO DE UMA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA 2
3 CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA Classificação Geral Método Específico F.E. Tipo Equil. Cromatografia Líquida (CL) (F.M.: líquido) Líquido-líquido ou partição Líquido ads. sólido Partição Fase líquido-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição Líquido-sólido ou adsorção sólido Adsorção Troca iônica Resina de troca iônica Troca iônica Exclusão por tamanho Líquido interstícios sólido Cromatografia Gasosa (CG) (F.M.: gás) Gás-líquido Líquido ads. sólido Partição Fase gás-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição Gás-sólido sólido Adsorção Cromatografia c/ fluido supercrítico (CFS) (F.M.: fluido supercrítico) Esp. org. ligadas sólido Partição CARACTERÍSTICAS DE UM PICO GAUSSIANO - A eficiência de uma coluna (medida do alargamento da banda de um pico) pode ser medida quantitativamente através de duas grandezas: (1) NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) - N mede a relação entre o tempo de retenção de um pico e a sua variância (σ) t R N s 2 t t R2 R2 N 16 N 5 54 w w b2 2 h 2, [7] F Quanto maior t R e menor s (ou w b ou w h ), maior será N. N é adimensional. 3
4 PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases IMPORTÂNCIA DO NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS N 1 > N 2 > N 3 4
5 IMPORTÂNCIA DE N NA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA N=2500 N=1500 EXEMPLO DE CÁLCULO DE N - Assumindo que t R = 5 minutos e w b = 0,5 min (atenção: t R e w b devem estar na mesma unidade; N é adimensional!!!) - Substituindo-se esses valores na equação de N =????? (2) ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H): compara eficiência de colunas de diferentes comprimentos H L N [8] L= comprimento da coluna N= número de pratos teóricos da coluna - H nos dá o comprimento da coluna que corresponde ao valor de um prato. - No exemplo anterior de cálculo de N, se considerarmos que a análise foi realizada em uma coluna de 30 cm, e sabendo-se que N=1600, substituindo-se na equação [8], temos: H = 30 cm / 1600 H = 0,01875 cm 5
6 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRAFIA GASOSA CROMATOGRAFIA À GÁS (ou GASOSA): CG ( GC ) Fase móvel: gás X Fase estacionária: sólido ou líquido CROMATOGRAFIA À GÁS (CG) 1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido. - Retenção dos analitos ocorre por adsorção física; - Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos); - Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros). 6
7 CROMATOGRAFIA À GÁS (CG) 1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido. - Retenção dos analitos ocorre por adsorção física; - Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos); - Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros). 2) Cromatografia gás-líquido: F.M. é um gás; F.E. é um líquido adsorvido ou quimicamente ligado a um suporte sólido. - Técnica denominada simplesmente de cromatografia gasosa; - Separação dos analitos baseada no fenômeno de partição; - Ampla aplicação em todas as áreas da ciência. CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDO (CGL) ou apenas (CG) - F.M. é um gás (não interage com analito); - F.E. é um líquido de alto ponto de ebulição adsorvido física ou quimicamente a um suporte sólido. suporte fase líquida Gás - O fenômeno físico-químico responsável pela interação do analito + F.E. líquida é a ABSORÇÃO. O equilíbrio envolvido no processo de eluição do analito da coluna é a PARTIÇÃO do analito entre a F.M. (gás) e a F.E. (líquido). - A absorção ocorre no INTERIOR da F.E. líquida (fenômeno INTRAfacial). 7
8 COMPONENTES DE UM SISTEMA DE CG Pressurização da fase móvel 2. Controle de fluxo 3. Introdução da amostra 4. Forno 5. Coluna 6. Detector 7. Aquisição e tratamento dos dados FOTOGRAFIA DE UM SISTEMA DE CG Estação de gases Injetor Integrador Forno e Coluna Painel de controle Forno com coluna Detector FID Gás de arraste Injetor Coluna capilar Integrador 8
9 resposta 6/16/2014 COMPONENTES AQUECIDOS EM UM SISTEMA DE CG Gás de arraste Registrador Injetor Coluna Aquecido para vaporizar amostra Detector Aquecida para controlar t R Tratamento de dados Aquecido para manter limpo AMOSTRAS TÍPICAS ANALISADAS POR CG Gases, líquidos ou sólidos (introduzidos na vapor de vapor); A amostra necessita ser VOLÁTIL; Massa molecular entre 2 e 1000 daltons; Compostos orgânicos ou inorgânicos. CROMATOGRAMA TÍPICO tempo de retenção 9
10 SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: MICROSERINGAS SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: VÁLVULAS DE INJEÇÃO Gás arraste P/ coluna P/ coluna Posição de injeção da amostra amostra loop injeção Posição de envio da amostra para coluna INTRODUÇÃO DE AMOSTRA EM CG: DEVE-SE EVITAR INTRODUZIR AMOSTRAS NA FORMA DE BANDAS LARGAS!!! t t=0 = 0 Banda Estreita Banda Larga t t=x = x 10
11 INJETOR TÍPICO DE UM SISTEMA DE CG Gás de arraste Seringa Coluna Septo Bloco aquecido Lã de vidro MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: SPLIT (divisão da amostra) descarte: 1 ml/min p/ coluna 1 ml/min Fluxo total: 102 ml/min descarte: 100 ml/min MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: SPLITLESS (sem divisão da amostra) descarte: 1 ml/min p/ coluna 1 ml/min Fluxo total: 2 ml/min descarte: 0 ml/min 11
12 MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: ON COLUMN (inj. direta na coluna) descarte: 0 ml/min p/ coluna 1 ml/min Fluxo total: 1 ml/min descarte: 0 ml/min MANIPULAÇÃO CORRETA DA SERINGA DE INJEÇÃO SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) 12
13 SPME: INTRODUÇÃO DA FIBRA NO SISTEMA DE CG SISTEMAS DE DETECÇÃO PARA CG - CARACTERÍSTICAS DO DETECTOR IDEAL PARA CG: 1. Sensibilidade adequada; 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade; 3. Resposta linear por várias ordens de grandeza; 4. Suportar altas temperaturas; 5. Resposta rápida; 6. Seletivo; 7. Não destrutivo. Nenhum detector apresenta todas as características citadas, sendo que sua escolha deve basear-se na finalidade analítica, bem como no tipo de amostra a ser analisada. Análise Qualitativa usando CG - A CG é um excelente método para a confirmar a presença ou ausência de um determinado analito em uma amostra (após a adição do padrão do composto de interesse, nenhum novo pico deve aparecer no cromatograma). - Existem basicamente três meios de ser realizar uma análise qualitativa utilizando a técnica de CG: 1. Tempo de Retenção 2. Métodos Gráficos (Índices) 3. Métodos Analíticos Auxiliares 13
14 Tempo de Retenção Tempo de Retenção Vantagens da CG Elevada resolução Alta velocidade de análise Alta sensibilidade Ótima exatidão 14
15 OTIMIZAÇÃO DE UMA SEPARAÇÃO POR CG - Comprimento da coluna; - Diâmetro interno da coluna; - Tubulação da coluna; - Fase líquida presente na F.E.; - Tamanho da amostra (quantidade injetada). INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE MÉTODOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (ou a LÍQUIDO) (CLAE OU HPLC ) CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HPLC: High Performance Liquid Chromatography Fase móvel: líquido X Fase estacionária: sólido ou líquido 15
16 EFICIÊNCIA DE UMA COLUNA DE CLAE Efeito do diâmetro da partícula 10 µm 5 µm 3 µm Eficiência como função do D p Tamanho da partícula D p (µm) t R (min) N o pratos (N) Pressão (bar) 5, , , , Cromatograma mostrando o efeito da eficiência como função do D p - CLAE não pode ser realizada em colunas capilares abertas : problema da baixa difusão do soluto na fase móvel líquida. 16
17 Em quais casos deve-ser usar a CLAE? MODOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA 1) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO (LÍQUIDO-LÍQUIDO) 2) CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (LÍQUIDO-SÓLIDO) 3) CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA 4) CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO (OU CROMATOGRAFIA EM GEL) APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE CLAE 17
18 Componentes de um sistema de CLAE Fotografia de uma sistema de CLAE (1) 18
19 Fotografia de uma sistema de CLAE (2) Componentes de um sistema de CLAE Reservatórios de F.M. a) Eluição com gradiente F.M.: início 40:60 (v/v) de metanol/h 2 O ; aumento do metanol numa razão de 8%/min. b) Eluição isocrática F.M.: 50:50 (v/v) de metanol/h 2 O durante toda a análise. 19
20 Sistemas de Bombeamento - Requisitos para um eficiente sistema de bombeamento: 1. Geração de pressões de até 6000 psi; 2. Saída com ausência de pulsos; 3. Velocidades de fluxo (vazão) variando de 0,1 a 10 ml/min; 4. Controle e reprodutibilidade relativa de fluxo de 0,5%; 5. Componentes resistentes a corrosão (aço inox ou teflon). Existem 3 tipos de bombas para CLAE: 1) bombas recíprocas, 2) bombas do tipo seringa e 3) bombas pneumáticas Sistemas de Injeção de Amostras - O método mais utilizado para introdução de amostras em CLAE está baseado em alças (em inglês, loop) de amostragem que podem ser trocadas de acordo com a necessidade analítica (volumes de 5 a 500 µl). - Alças de amostragem permitem a introdução de amostras a pressões de até 7000 psi com excelente precisão. Sistema de alça de amostragem para CLAE Posição de Carregamento da Amostra (load) Posição de Injeção (Inject) 20
21 Colunas para CLAE - As colunas para CLAE geralmente são construídas em tubos de aço inox. Os custos variam em torno de 200 a 1000 doláres (ou mais), dependendo do tipo de F.E. Coluna típica para CLAE Colunas analíticas usadas em CLAE Detectores utilizados em CLAE - Diferente do que ocorre em CG, em CLAE não existe um detector universalmente aplicável, como o FID. - O detector ideal em CLAE deve ter as mesmas propriedades listadas para os detectores de CG, com exceção do fornecimento de resposta em grande intervalo de temperatura. - Os detectores usados em CLAE são de dois tipos básicos: 1) Detectores de propriedades universais: respondem a propriedades da F.M. como um todo (ex: índice de refração) 2) Detectores de propriedades do soluto: respondem a certas propriedades do soluto, como absorbância no UV ou fluorescência. 21
22 Principais detectores utilizados em CLAE Detectores de Absorbância > Volume cela pequeno: 1 a 10 µl > L da cela: 2 a 10 mm > Cela em Z : aumento do caminho óptico Detectores de Absorbância UV 1) UV com Filtros - São fotômetros, com uma lâmpada de mercúrio como fonte. A linha em 254 nm (mais intensa) é isolada por filtros. - Outras linhas podem ser isoladas: 250, 313, 334 e 365 nm. - Esse tipo de detector é restrito a compostos que absorvem radiação em tais comprimentos de onda. - Fontes de filamento de deutério e de tungstênio com filtros apropriados também podem ser úteis para algumas aplicações. 22
23 1) UV com Monocromadores - A maioria dos equipamentos de CLAE vem equipados com um espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, incluindo a radiação UV e Visível. - Com esses equipamentos pode-se utilizar-se de diferentes comprimentos de ondas (aquele apropriado para cada pico sendo eluído da coluna) se os compostos são suficientemente separados um do outro. - Os detectores espectrofotométricos UV mais poderosos são aqueles equipados com arranjo de diodos, que permitem a coleta de dados de um espectro inteiro em cerca de 1 segundo. Detector de UV com arranjo de diodos para CLAE Detectores de Fluorescência - O esquema desse tipo de detector é similar aos fluorímetros e espectrofluorímetros, com a fluorescencia sendo observada perpendicularmente ao eixo de excitação. - Os detectores mais simples usam uma fonte de mercúrio com um ou mais filtros para isolar a bande de emissão de radiação. - A grande vantagem dos detectores de fluorescência está na sua alta sensibilidade. - Detectores de fluorescência são utilizados em CLAE na análise de compostos farmacêuticos, produtos naturais e produtos do petróleo. 23
24 Detectores de Índice de Refração - Esse tipo de detector tem a vantagem de responder a quase todos os analitos. As desvantagens incluem sua alta sensibilidade a mudanças de temperatura e a sua baixa sensibilidade de detecção. Esquema de um detector de índice de refração diferencial Detectores Eletroquímicos - São baseados nos fenômenos de amperometria, polarografia, coulometria e condutometria. Sendo que o mais utilizado baseia-se na amperometria (simplicidade). Grupos funcionais detectáveis por amperometria Cela de um detector amperométrico para CLAE 24
25 MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE Cromatografia de Partição - Pode ser subdividida em: cromatografia líquido-líquido e cromatografia de fase ligada. - Cromatografia líquido-líquido: a F.E. líquida é adsorvida fisicamente sobre a superfície de um suporte sólido. - Cromatografia fase ligada: a F.E. é quimicamente ligada sobre a superfície de um suporte. Colunas para Cromatografia de Fase Ligada - A grande maioria dos suportes para F.E. utilizados em CLAE são preparados à base de sílica. 25
26 - Os recobrimentos mais utilizados como fase ligada são siloxanos formados por reação da superfície hidrolisada da sílica com um organoclorossilano: - A cobertura por silanização está limitada a 4 µmol/m 2 devido a efeitos estéricos. Para desativar os grupos SiOH restantes faz-se umareação com trimetilcloro-silano (processo chamado endcapping). Cromatografia de Fase Ligada: Fase Normal e Fase Reversa - A subdivisão da cromatografia de fase ligada em fase normal e fase reversa está baseada na polaridade relativa das fases móvel e estacionária. CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL - Nesse modo de cromatografia, a F.E. é polar e a F.M. é não-polar. - Em cromatografia de fase normal, a F.E. tem caráter polar (sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais polares): - Em cromatografia de fase normal, os analitos polares tem maior afinidade pela F.E. (polar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna e são os últimos a serem eluídos da coluna: Fase estacionária polar (sílica, NH 2, CN) Fase móvel apolar (Hexano, diclorometano) amostra Analito mais polar Analito mais apolar - A F.M. não contém água. Os solventes mais comumente utilizados são: hexano e diclorometano. Um solvente e característica polar (como metanol) pode ser usado em pequenas proporções para dar seletividade a F.M. na eluição de analitos mais polares. - A cromatografia de fase normal é mais utilizada na análise de compostos lipofílicos: óleos, gorduras, lípidios. 26
27 CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA - Nesse modo de cromatografia, a F.E. é não-polar e a F.M. é polar. - Em cromatografia de fase reversa, a F.E. tem caráter apolar (sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais apolares): Octadecil (C18) Octil (C8) - Em cromatografia de fase reversa, os analitos apolares tem maior afinidade pela F.E. (apolar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna e são os últimos a serem eluídos: (A) analito mais polar (B) analito menos polar Suporte da partícula Fase ligada Área intersticial (F.M.) 27
28 Fase estacionária apolar (C8, C18) Fase móvel polar (metanol, acetonitrila, água) amostra Analito mais apolar Analito mais polar - A F.M. contém água. Os solventes mais comumente utilizados são: metanol e acetonitrila. A força de eluição para os analitos é dada pela proporção do solvente orgânico. A proporção de água na F.M. é utilizada para controlar o processo de retenção dos analitos. - Fase Reversa é o modo de CLAE mais utilizado (em cerca de 75% dos métodos). Pode ser utilizado na separaç ão de compostos não iônicos, polares, até a compostos de polaridade intermediária. Efeito do Solvente em Fase Reversa separação rápida separação lenta separação muito lenta 28
29 Efeito do Tamanho do Cadeia sobre a Eficiência de Separação Fase Normal x Fase Reversa: tempos de eluição para uma mistura de compostos Desenvolvimento de Métodos em Cromatografia de Partição (Fase Normal e Fase Reversa) Seleção da Coluna - A polaridade da F.E. da coluna deve ser combinada de maneira próxima com a polaridade dos analitos a serem separados. A F.M. (de polaridade diferente) é usada para eluição. - Uma vez feita a escolha da F.M. e da F.E., o analista deve realizar uma série de experimentos (tentativa e erro) até conseguir a separação dos analitos de interesse. Caso a separação não seja ideal, deve-se escolher outro sistema F.M./F.E. - Polaridade dos analitos: hidrocarbonetos < éteres < ésteres < cetonas < aldeídos < amidas < aminas < alcoóis < água. 29
30 Seleção da Fase Móvel - A F.M. em cromatografia de partição deve ser escolhida de modo a se obter uma resolução adequada para todos os compostos em estudo. - Em CLAE a maneira mais fácil de se obter uma boa resolução é através da manipulação do fator de retenção (k), que é muito dependente da F.M. utilizada. > Isso pode ser feito variando-se a proporção dos solventes utilizados na F.M. - Caso os ajustes dos valores de k não dêem os resultados esperados na resolução, a variação nos fatores de retenção (α) devem ser realizados. > Isso pode ser feito mudando-se a composição dos solventes usados na F.M. APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO - A cromatografia de partição, mais especificamente a cromatografia em fase reversa, aproxima-se de um sistema universal ideal para a cromatografia líquida devido à sua ampla aplicabilidade e facilidade de manipulação dos fatores k e α quando se utiliza uma fase móvel aquosa. 30
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