INSTRUÇÃO DE TRABALHO Determinação de cafeína por CLAE

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1 Página: 1 de 5 Nome Função Assinatura Data Elaboração: Liliamarta Novato Colaboradora Análise crítica: Alessandra Pulcineli RQ Substituta Aprovação: Francisco Jairo R. Fonseca RT 1. Objetivo A cafeína pode ser separada e quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC, sigla em inglês). Esta técnica baseia-se na separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária (coluna C18) e outra móvel (eluente) conforme a interação destes com as referidas fases. 2. Aplicação Identificação e quantificação de cafeína em bebidas, no LABV do Lanagro-GO. 3. Referências Normativas e/ou Bibliográficas - AQUINO, F.W.B., AMORIM, A.G.N., PRATA, L.F. Determinação de aditivos, aldeídos furânicos, açúcares e cafeína em bebidas por cromatografia líquida de alta eficiência: validação de metodologias. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v.24, n.1, p.32-38, jan.-mar BRASIL. Portaria n 544, de 16 de novembro de Aprova os Regulamentos Técnicos para fixação dos padrões de identidade e qualidade, para refresco, refrigerante, preparado ou concentrado líquido para refresco ou refrigerante, preparado sólido para refresco, xarope e chá pronto para o consumo. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 17 de nov Termos e Definições CLAE FOR HPLC IT LABV ou BV Lanagro-GO POP RT UGQ Cromatografia líquida de alta eficiência Formulário Cromatografia líquida de alta eficiência Instrução de Trabalho Laboratório de Análise Físico-Química de Bebidas e Vinagres Laboratório Nacional Agropecuário em Goiás Procedimento Operacional Padrão Responsável Técnico Unidade de Gestão da Qualidade

2 Página: 2 de 5 5. Descrição da Instrução de Trabalho 5.1. Material Equipamentos - Banho de ultrasom. - Bomba de vácuo; - Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) modelo S-200 composto por: Sistemas com Bomba Quaternária, Injetor Automático, Forno de Coluna, Detector UV/VIS, LINK, NCI 900, Black Box e computador; - Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) modelo FLEXAR composto por: Sistemas com Bomba Quaternária Flexar LC Pumps, Injetor Automático, Detector UV/VIS Flexar PDA LC, e computador; - Micropipetas (faixas de 20 a 200 µl e 100 a 1000 µl); - Pré-coluna RP-18 (dimensões: 15 x 3.2 mm; tamanho de partícula: 5 µm) e coluna C18 (dimensões: 250mm x 4,6mm; tamanho da partícula: 5µm); Vidrarias e outros materiais - Conjunto para filtração: filtro e kitazato. - Ponteiras para micropipetas (20 a 200 µl e 100 a 1000 µl); - Balões volumétricos de volumes variados (calibrados); - Béqueres de vários tamanhos; - Membranas filtrantes (diâmetro: 44 mm e poro: 0,22 µm; diâmetro: 13 mm e poro: 0,22 m; diâmetro: 13 mm e poro: 0,45 µm); - Vials de 2mL; - Seringa Reagentes e soluções - Acetonitrila (grau cromatográfico); - Água ultra-pura. - Cafeína anidra p.a.; 5.2. Descrição da metodologia Preparação de fase móvel - Acoplar os frascos dos reagentes nas bombas do cromatógrafo seguindo a ordem: * Bomba C Acetonitrila * Bomba B Água ultra-pura

3 Página: 3 de 5 - Seguir a IT BV 232 Operação e Controle do Cromatógrafo Líquido ou IT LABV 384 Operação e Controle do Cromatógrafo Líquido Modelo FLEXAR, conforme equipamento utilizado, para procedimento de purga das bombas antes do início das análises Preparo dos padrões a) Solução-mãe: - Pesar em béquer cerca de 50mg de cafeína anidra; - Diluir com água ultra-pura e transferir para balão volumétrico de 100mL, completando o volume; - Filtrar a solução em membrana de 0,22µm, através de conjunto para filtração acoplado a bomba de vácuo ou em membrana filtrante de 0,22 m, diâmetro de 13mm, acoplada em seringa. Registrar no FOR UGQ 056 Controle de preparo de soluções, o controle da solução. - A solução apresentará concentração de aproximadamente 50mg/100mL; - Preparar as diluições da curva de calibração seguindo volumes estabelecidos no FOR BV 285 Preparo da curva de calibração CLAE, para se obter 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e 1,25 mg/100ml para curva de baixa concentração e 0,5; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 12,5 mg/100ml para curva de alta concentração; - Injetar os pontos em triplicata. b) Solução controle Preparar solução de padrão na concentração determinada como ponto de controle para ser analisada em triplicata, juntamente com a sequência de amostras. Anotar os resultados obtidos no FOR UGQ 066 Coleta de dados - carta controle. Seguir os critérios de verificação descritos na IT UGQ 025 Montagem de carta controle para análise dos resultados. Além de permitir o controle intralaboratorial a cada dia de análise, também permite a indicação do tempo de retenção esperado. c) Preparação da amostra - Pré-tratamento: desgaseificação e filtração em membrana 0,45µm; - Transferir a amostra pré-tratada para vial, para injeção. Bebidas com concentração de cafeína fora da faixa de trabalho da curva de calibração, devem ser diluídas com água ultra-pura para ajuste à curva de calibração do método validado Preparação da condição de separação

4 Página: 4 de 5 Através da criação do método de ensaio conforme estabelecido na IT BV 232 Operação e Controle do Cromatógrafo Líquido, estabelecer as seguintes condições de separação: - Fase estacionária: C-18 - Fase móvel: acetonitrila: água (20:80) - Condição de eluição: isocrática - Vazão: 1mL/min - Temperatura do forno: ambiente (quando houver) - Volume injetado: 10µL - Detector UV/Vis: 285nm - Tempo de retenção: aproximadamente 4,2 4,5 min. - Tempo de corrida: cerca de 6 min.. - Faixa de trabalho: ~0,1 a 1,25mg/100mL (bebidas com baixa concentração) ~0,5 a 12,5mg/100mL (bebidas com alta concentração) Nota 1: Condições cromatográficas e de fase móvel podem ser alteradas de acordo com a coluna utilizada Cálculos e expressão de resultados No cromatógrafo modelo S-200 módulo Reprocess - Results e no cromatógrafo modelo FLEXAR módulo Pos Run do software dos equipamentos encontram-se os cromatogramas com os resultados para cada amostra. O cálculo é efetuado automaticamente pelo software a partir da curva de calibração previamente elaborada. Existe a possibilidade de ocorrer uma pequena variação entre os tempos de retenção de um dia de trabalho para o outro, sendo neste caso utilizado a solução de controle para confirmação dos tempos de retenção do dia. Quando ocorrerem variações nos tempos de retenção é necessário que se proceda ao ajuste na integração dos picos ou no método de integração se as variações persistirem. Os resultados obtidos através da curva de calibração são expressos em mg/100ml, devendo-se considerar o fator de diluição da amostra, quando houver, na expressão do resultado final. Nota 2: Se as variações nos tempos de retenção persistir, mesmo após a integração dos picos, deverão ser realizadas ajustes no método. 6. Controle de Registros FOR UGQ 056 Controle de preparo de soluções FOR UGQ 066 Coleta de dados - carta controle

5 Página: 5 de 5 FOR BV 285 Preparo da curva de calibração CLAE 7. Controle de Alterações Item Revisão Data da alterado alterada alteração Descrição da alteração Quadro de aprovação 01 09/10/ /10/13 Adequação do nome da Portaria /10/ /10/13 Inclusão do uso de seringa /10/13 Inclusão da IT LABV /10/13 Inclusão da Nota 1 Anexos /10/13 Item não se aplica a este documento. Alteração do colaborador responsável pela aprovação desta revisão. Inclusão do cromatógrafo líquido modelo Flexar. Adequação do procedimento descrito no item.

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