HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência

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1 HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência HPLC High Performance (pressure) Liquid Chromatography nas colunas de enchimemto o fluxo é baixo mesmo para granulometrias elevadas ( µm) < granulometria < HEPT - exige pressões muito elevadas mistura de nucleosidos min / psig Condições actuais: min / 400 psig ,25 min / 5000 psig colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 µm psig / pratos / m 1 psig = 108 kpa HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que, para ter um fluxo razoável, opera a pressões elevadas Constituíntes Sistema de solventes Bombas Injector Coluna Detector Aquisição e trat. de dados

2 Enviar até para: Validação Num laboratório de cromatografia com dois analistas foram realizados vários testes para verificar se o método em uso para a determinação por GC de etanol em hiclato de doxiciclina (valor teórico: 4,5%) poderia ser considerado válido. Foram obtidos os seguintes resultados: tempos de retenção relativos: metanol: 0,3 / acetona : 0,6 / etanol 1,0 Metanol e acetona são possíveis impurezas solução amostra: / / / / Soluções de etanol a: 20%: 3120 / 40%: 4980 / 60%: 7305 / 80%: 9850 / 100%: / 120%: solução amostra (repetição): / / / / solução amostra (outro dia /analista): / / / / Nota: as percentagens indicadas dizem respeito ao valor teórico: 4,5%. O método é selectivo? Qual o valor obtido? Que conclusões poderá tirar quanto à validade do método e à destreza dos analistas envolvidos na determinação? Que sugeria para melhorar a confiança no resultado?

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5 Resolução Desconhecendo a resolução dificilmente se pode dizer se um método é selectivo Se 4,5 % é a percentagem teórica, corresponde à solução a 100%!! Por isso se indicam soluções acima e abaixo deste valor Não se pode confundir o significado dos 4,5% e da % das soluções padrão A maioria dos alunos retirou a solução a 20% que neste caso não seria preciso A área foi mudada de 3500 para 3120 Claramente um dos analistas tem falta de formação Nota: os resultados de ambos os analistas são exactos mas um deles pouco preciso A repetibilidade pode ser boa mas não a reproductibilidade A solução não é colocar o bom analista a fazer sempre o método mas dar formação ao outro analista Resultado Quando se indica que o valor teórico é de 4,5 % significa que se admite que o erro esteja no 5! Não tem valor indicar um resultado com 3 algarismos significativos Seria diferente se o valor teórico fosse de 4,50 %

6 HPLC Sistema de solventes desgaseificação / vácuo - hélio (sparging) Bombas bombas de duplo pistão válvulas proporcionais câmara de mistura eluição isocrática - composição da FM é constante eluição de gradiente - composição da FM varia ao longo do cromatograma Bombas isocráticas Bombas binárias Bombas quaternárias

7 Bombas Bombas pressão elevada (> 6000 psig) - riscos de fugas saída contínua (sem pulsação) / pistão fluxos de 0,1 a 10 ml/min reproductibilidade de fluxo de 0,5%!!

8 Injector Injector o uso de septum é limitado a cerca de 1500 psig injecção em loop de volume fixo ( µl) típico 20 µl Autoinjector Capacidade de preparação de amostras

9 HPLC - colunas Enchimento sílica (aglomeração de partículas altamente regulares eventualm. cobertas por filme orgânico alumina / polímeros porosos / resinas permutadoras de iões colunas colunas de de aço aço com com a a cm cm de de comprimento comprimento e e 4 4 a a mm mm de de diâmetro diâmetro interno interno enchimento enchimento de de 5 5 a a µm µm / / psig psig / / pratos pratos / / m Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / < psig / 3 ou 5 µm / até pratos / m Vantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes 3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System HPLC Columns

10 HPLC - enchimentos A cromatografia de partição representa a maioria das aplicações líquido-líquido: fase estacionária é um solvente adsorvido no suporte (apenas usado ocasionalmente) fase ligada: fase estacionária orgânica está ligada à superfície do suporte por ligações covalentes (> estabilidade - > uso) Enchimentos de fase ligada / / CH3 / / CH3 - Si -- OH + Cl - Si -- R --Si -- O -- Si -- R ; R = octil (C(8) / octadecil (C18) \ \ CH3 \ \ CH3 outros grupos funcionais: aminas alifáticas / éteres / nitrilos / hidroc. aromáticos maior estabilidade / apresenta alguma limitação na capacidade de amostra Cromatografia de fase normal fase estacionária polar / fase móvel não polar - o soluto menos polar elui primeiro água; trietilenoglicol; CN / hexano, éter isopropílico Cromatografia em fase reversa (+ de 75 % das aplicações) fase estacionária não polar / fase móvel polar / soluto mais polar elue primeiro C8; C18 / soluções aquosas de metanol, acetonitrilo, THF; soluções tamponadas

11 Pré-colunas + forno Pré-colunas aumento da vida das colunas mesma (similar) composição da fase estacionária / maior granulometria remoção de partículas e contaminantes dos solventes saturação da fase móvel com a fase estacionária Forno de colunas TA C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das aplicações) Maior a temperatura menores os tempos de retenção Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna para a quantificação a termostatização é essencial (± 0,1 C) A identificação é essencialmente feita com base nos tempos de retenção

12 HPLC

13 Detectores HPLC

14 Espectro electromagnético A espectroscopia - estudo da interacção da radiação electromagnética com a matéria Espectro - representação bidimensional da força da interacção vs. energia raios Espectro cósmicos electromagnético transições nucleares raios gama raios x UV VIS IV micro ondas ondas rádio e - internos excitação electrónica vibração molecular rotação molecular spin electrónico RMN λ, cm Espectroscopia / espectrometria - quantitativa informação geral / informação a espectroscopia está na base do grande desenvolvimento da ciência actual, desde a química à astronomia

15 Fenómenos associados à absorção da luz R - Relaxação vibracional A - Absorção F - Fluorescência (mesmo spin) P - Fosforescência (spins dif.) IC - Conversão Interna (mesmo spin) ISC - conversão intersistema (spins dif.) P aparece sempre a maiores comprimentos de onda (< E) que F Ambos os fenómenos são raros devido aos tempos de vida muito curtos

16 HPLC - detectores Os detectores de absorção (UV + Vis) são usados na maioria das aplicações células analíticas detector de foto-diodos (diode array) Sensitivity (toluene) 5x 10-8 g/ml Sensitivity 1 x 10-7 g/ml Linear Dynamic Range 5 x 10-8 to 5 x 10-4 g/ml Linear Dynamic Range 5 x 10-7 to 5 x 10-4 g/ml Response Index Response Index

17 UV comprimento de onda 360nm

18 DAD

19 Comparação de espectros UV

20 Fluorescência vs. UV

21 HPLC Critérios de escolha uma boa separação representa sempre um balanço entre as forças intramoleculares que se estabelecem entre amostra e fases estacionária e móvel usar uma fase estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma fase móvel de polaridade muito diferente o contrário é possível mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos) polaridades idênticas (amostra e fase estacionária) pode levar a tr muito longos alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separação Aspectos experimentais temperatura estável para trr reproductíveis desgaseificação dos solventes 2-3 réplicas e soluções padrão limite de detecção - menor concentração detectável (3x acima do ruído de fundo) limite de quantificação - menor concentração determinada sem ambiguidade (10x vezes o ruído de fundo) Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha não lineares) Cs Cs Cs Cm Cm Cm

22 Trabalho Descreva de forma breve o funcionamento de um detector ELSD Entregar por mail até 11 de Maio

23 Tratamento de amostras Amostras puras apenas necessitam do solvente apropriado (solubilização seguida de filtração) o solvente deverá ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase móvel usar THF ou metanol em fase reversa (água) pode provocar perdas de resolução a escolha do solvente pode ser condicionada pelo detector utilizado Amostras compostas a presença de impurezas não dissolvidas exige, no mínimo, uma filtração extração da matriz (excipientes) necessidade de determinar a % de recuperação uso de solventes diferentes do usado na injecção exige reconstituição da amostra extração / concentração / reconstituição pré-colunas / separação de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak) Amostras biológicas caracterizadas por concentrações muito baixas precipitação das proteínas (acetonitrilo + centrifugação) / concentração / reconstituição

24 SPE

25 LLE

26 Derivatização Aminoácidos Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl carbamate Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS) Reacção completa num minuto Derivados estáveis (+ de 1 semana) Fluorescem a 395 nm AccQTag column 3.9 x 150mm (waters) Fluorescence detection with 250 nm excitation, 395 nm emission UV detection at 248 nm A 140mM NaAC, 6.9mM Triethylamine, EDTA (1ml of a 1mg/ml solution per liter) ph to 5.8 w / 5-10% phosphoric acid solution B Acetonitrile C Water

27 Cromatografia preparativa

28

29 Aquisição e tratamento de dados Automação o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos preparação da amostra / injecção / controlo / aquisição / tratamento de dados sistemas de optimização de separações cromatográficas Aquisição de dados Hz ( > 8 pontos por pico) para definir um pico são precisos pelo menos 3 pontos a subir e 3 a descer armazenagem (identificação) Tratamento de dados acumulação / smoothing / integração / derivatização determinação de tempos (t r ) e intensidades (áreas / alturas) integração - definição do princípio e fim do pico picos mal definidos (falta de resolução e tailing ) correção da linha de base tratamento à posteriori utilizando novos parâmetros ( threshold / integração) não melhora a separação!!

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