Cromatografia Líquida

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1 Analítica V Aula 11: Cromatografia Líquida PRÓXIMA AULA TEÓRICA (Eletroforese Capilar): , às 08:15h, como Prof. Marcone Prof. Rafael Sousa Departamento de Química - ICE Notas de aula:

2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL) em Inglês Interação diferenciada dos componentes da amostra entre FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL sólido ou líquido líquido Crom. líquida (CL)

3 Uma das diferenças entre a CG e a CL são as configurações experimentais: FASE ESTACIONÁRIA Sólido líquido sobre um sólido CONFIGURAÇÃO EXPERIMENTAL PLANAR COLUNA

4 Ex de interação analito - FE Equilíbrio FE FM (partição na crom. Líquido-líquido) Diferente para as substâncias diferentes Polaridade Tamanho

5 Cromatografia planar Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido FM (capilaridade) separação Fácil realização Análises quali e quantitativas Baixo custo Baixas - Resolução e - Repetibilidade - Reprodutibilidade

6 Cromatografia em coluna Convencional (Clássica) Líquida de alta eficiência - CLAE (HPLC) Solvente Fase estacionária Suporte inerte - Colunas verticais (FM - gravidade) - Análises quali e quantitativas - Baixo custo - Baixa frequência - Desempenho regular - Colunas e FM altas pressões - Análises quali e quantitativas - Desempenho analítico satisfatório - Rapidez analítica, automação - Custo elevado...

7 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) - Amplamente utilizada - Dentre as modalidade mais importantes da cromatografia - Vem se desenvolvendo desde a década de 70 NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA Necessidade de calibração RESULTADO : Amostras x Padrões (cromatograma)

8 Subdivisões da CLAE Tipo de FE e o MECANISMO de separação Cromatografia líquido-sólido: CLS FE é um sólido mecanismo de adsorção Cromatografia líquido-líquido: CLL FE é um líquido que recobre um sólido mecanismo de partição Cromatografia líquida de fase ligada: CLFL FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido mecanismo de partição

9 Cromatografia por exclusão: CE FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controlada Aplicação importante: análise de polímeros (GPC) Cromatografia de troca iônica: CTI FE sólida contém grupos NR 3+ (para troca aniônica) ou grupos SO 3- (para troca catiônica) Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc) Mesmo mecanismo estudado da Prática 10!

10 Cromatografia por afinidade: CA FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletiva com proteínas e anticorpos Cromatografia quiral: CQ FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagir seletivamente com compostos quirais

11 Separação e Sinal analítico FM FM FM FM FM FM + componente separado Sinal Tempo de retenção Cromatograma

12 Entendendo o cromatograma Diferentes espécies SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr (tr= tempo de retenção medida em função do tempo) Resposta do detector sacarina aspartame benzaldeído Informações quali e quantitativas Pouca interação Tempo de retenção Muita interação

13 Análise quantitativa Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com áreas diferentes Necessidade de calibração: Resposta do detector Equação de reta Concentração do padrão, no tr específico Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES

14 Configuração instrumental Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência: Coluna cromatográfica Processador-Registrador Detector Reservatório de FM Válvula de amostragem Sistema de bombeamento Cada componente: função no processo analítico

15 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador frasco de plástico ou vidro Água + Solvente(s) orgânico(s) Ciclohexano Tetracloreto de carbono Tolueno Etanol Acetato de etila Metanol Acetonitrila Água Ordem crescente de polaridade (VERIFICAR TABELAS) CUIDADOS eliminação de partículas maiores que 5 µm retirada de gases Dissolvidos Ultrasom ou Borbulhamento gases inertes USO (preparação diária)

16 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível BOMBAS DE ALTA PRESSÃO Composição constante eluição ISOCRÁTICA Composição variável Eluição por GRADIENTE ou Eluição por programação de solvente Amostras complexas Compostos de polaridade muito diferente Bomba de seringa Bomba recíproca Bomba pneumática Proporção do Solvente mais polar

17 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Ex: Bomba recíproca (uma das mais usadas) Para coluna Vantagem: Mudança da fase móvel Desvantagens: Vazão pulsada amortecedor Cavitação (bolhas) devido à compressão

18 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de amostragem que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna ALÇA TROCÁVEL Volumes de 2 a 1000 µl

19 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Coluna tubo de aço inoxidável separação Capacidade: dimensões Фi= 1 20 mm L= 3 25 cm (limitado pela P trabalho ) FE Partículas com Ф na faixa de µm Uso de partículas pequenas melhor separação (aumenta N) + DUAS COMBINAÇÕES Fase reversa FE apolar (baixa polaridade) FM polar FM Fase normal FE polar FM apolar (baixa polaridade)

20 EFICIÊNCIA DA COLUNA - Determina a resolução do cromatograma - Relacionada ao n o de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na FM REPRESENTADADA POR N Número de pratos teóricos N = 16 tr W 2 Sinal do detector Tempo de retenção Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação Não implica em rapidez! Esta é dada pela Altura do prato (H): H= L / N, em que valores pequenos referem-se a colunas rápidas

21 Reservatório de FM Sistema de bombeamento Válvula de amostragem Coluna cromatográfica Detector Registrador Detecção dos componentes conforme saem da coluna Deve-se obter UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE) a) Detectores que respondem à concentração SINAL proporcional à CONCENTRAÇÃO Ex: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência MAIS GERAIS PORÉM MENOS SENSÍVEIS b) Detectores que respondem à massa SINAL proporcional a um FLUXO DE MASSA por unidade de tempo Ex: Detectores eletroquímicos e de condutividade elétrica MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO PERMITEM ELUIÇÃO COM GRADIENTE

22 Considerações práticas Várias configurações instrumentais podem ser empregadas determinação de vários tipos de substâncias (mesmo em amostras complexas) sistema à alta pressão: checar vazamentos As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciam no resultado para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrões internos (substância com características físico-químicas semelhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida)

23 Questões 1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles. 2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes em analgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveis diferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% água; Y: 60% MeOH/ 40% água; Z: 40% MeOH/ 60% água). Considerando essas informações, responda qual é o composto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essa mesma separação. X Y Z

24 Referências Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis 5 th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998 Harris, D. C. Análise Química Quantitativa 7 a ed., LTC Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008 Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S. Fundamentos de Cromatografia 1 a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006

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