Amostragem. Amostragem

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1 Amostragem 1 Amostragem conjunto de operações com as quais se obtém, do material em estudo, uma porção relativamente pequena, de tamanho apropriado para o trabalho no laboratório, mas que ao mesmo tempo represente correctamente todo o conjunto da amostra maior ou menor dificuldade na amostragem depende da homogeneidade da amostra processo de amostragem série sucessiva de etapas operacionais especificadas para assegurar que a amostra seja obtida com a necessária condição de representatividade 3 etapas principais: colheita da amostra bruta preparação da amostra de laboratório preparação da amostra para análise Amostragem 2 colheita da amostra bruta amostra bruta deve ser uma réplica, em ponto reduzido, do universo considerado, tanto no que diz respeito à composição como à distribuição do tamanho da partícula amostras fluidas homogéneas recolhidas a partir do topo, meio e fundo do recipiente, após agitação e homogeneização amostras sólidas previamente moídas e misturadas 1

2 Amostragem 3 fórmula geral para determinar qual a amostra bruta a colher N c n N nº de unidades colhidas c factor ligado ao grau de precisão e homogeneidade da amostra (c < 1 para população homogénea e c > 1 para população heterogénea) n - população Amostragem 4 preparação da amostra de laboratório amostra bruta frequentemente grande demais para ser convenientemente trabalhada no laboratório reduzida alimentos secos redução manual ou por equipamentos alimentos líquidos líquido bem homogeneizado no recipiente; retirar porções de diversas zonas e misturá-las no final alimentos semi-sólidos amostras raladas, procedendo de seguida de modo análogo ao das amostras sólidas queijos duros, chocolates 2

3 Amostragem 5 alimentos húmidos amostra picada ou moída e misturada; retirar uma alíquota suficiente para a análise armazenar sob refrigeração carnes, peixes, vegetais alimentos semi-viscosos e pastosos e líquidos contendo sólidos amostras picadas em liquidificador, misturadas e alíquotas retiradas para análise pudins, molhos, compotas, produtos enlatados alimentos com emulsão amostras aquecidas a 35 ºC num frasco com tampa e depois agitado para homogeneização. Retiradas as alíquotas necessárias para análise manteiga, margarina Amostragem 6 frutas frutas grandes cortadas ao meio nos sentidos longitudinal e transversal de modo a obter 4 partes. 2 partes opostas são juntas e homogeneizadas num liquidificador frutas pequenas homogeneizadas inteiras no liquidificador 3

4 Amostragem 7 preparação da amostra para análise depende da natureza da amostra e do método analítico envolvido Amostragem 8 conservação da amostra quando não é possível analisar as amostras em fresco inactivação enzimática diminuição das alterações lipídicas controlo do ataque oxidativo controlo do ataque microbiológico 4

5 Amostragem 9 variabilidade da amostra alimentos têm composição muito variada alimentos frescos de origem vegetal têm composição mais variada que os de origem animal frutas e vegetais da mesma variedade podem ter composições diferentes ou a composição pode variar após a colheita Amostragem 10 factores que influenciam a composição dos alimentos de origem vegetal: constituição genética; variedade condições de crescimento estádio de maturação tempo e condições de armazenamento parte do alimento a ser analisada factores que influenciam a composição dos alimentos de origem animal: teor em gordura parte do animal alimentação do animal idade do animal raça 5

6 Amostragem 11 factores que influenciam a composição dos alimentos após a colheita: perca ou absorção de humidade perca de constituintes voláteis decomposição química e enzimática oxidação provocada pelo arejamento durante a homogeneização remoção de materiais estranhos ataque microbiano contaminações (metais, ) 12 Química analítica análise qualitativa identificação dos componentes de uma amostra análise quantitativa determinação da quantidade de material presente numa amostra alguns métodos mais adequados para análise qualitativa, outros para análise quantitativa. Existem métodos adequados para ambas 6

7 13 tipos de métodos: gravimétricos métodos baseados na medida do peso por titulação métodos baseados na medição de um volume electroquímicos medição do potencial, intensidade, resistência, carga, espectroscópicos interacção de um analito com radiação electromagnética cromatográficos separação de um material devido à sua interacção com 2 fases diferentes quimiométricos tratamento estatístico dos dados 14 calibração do método resposta medida é proporcional à concentração do analito estabelecer uma relação entre a resposta medida e a concentração do analito utilizam-se padrões para calibrar essa relação padrões devem ser preparados do mesmo modo que a amostra padrões devem ter uma composição semelhante à da amostra padrões devem ser preparados na gama de concentrações esperada para a amostra 7

8 15 análises gravimétricas métodos baseados na precipitação de compostos insolúveis métodos baseados na volatilização de um analito depois de volatilizado, é pesado e determina-se quanto perdeu 16 começa-se por pesar a amostra converte-se a amostra num precipitado mensurável se a forma mensurável for o analito % analito = (peso analito/ peso amostra) x 100 normalmente, a forma mensurável contém o analito juntamente com outros materiais peso do analito determinado através do factor gravimétrico 8

9 17 características desejáveis num precipitado: baixa solubilidade fácil de recuperar por filtração não reagir com o ar, água, analito seja apenas uma pequena parte do precipitado facilita cálculo da estequiometria mecanismos de precipitação: nucleação quando há união inicial de um pequeno nº de iões, átomos ou moléculas espontânea ou induzida crescimento de partículas crescimento tridimensional de uma partícula, originando um cristal 18 9

10 19 nucleação e crescimento de partículas são processos competitivos desejável que o crescimento de partículas seja o factor preponderante na formação de precipitados resulta em precipitados cristalinos e não em suspensões coloidais formação de precipitados cristalinos favorecida por: temperatura elevada controlo do ph utilização de soluções diluídas adição lenta de reagentes agitação da solução 20 problemas encontrados durante a precipitação: coprecipitação de materiais que normalmente são solúveis absorção à superfície contra-iões absorvem à superfície oclusão se o crescimento do cristal for muito rápido, alguns contra-iões não têm tempo para escapar da superfície 10

11 21 formação de cristais mistos se estiverem presentes iões semelhantes, estes podem substituir parcialmente o analito aprisionamento mecânico quando crescimento rápido aprisiona parte da solução 22 após filtração do precipitado, este é seco até se obter um peso constante 11

12 23 vantagens e desvantagens dos métodos gravimétricos lentos; longos tempos de espera requerem pouco equipamento; balança, forno não requerem calibração exactidão de 1 2 ppm sensibilidade limitada a concentrações do analito > 1 % razoavelmente selectivos 24 Densimetria usada sobretudo em amostras líquidas, embora também possa ser utilizada em sólidos picnometria método mais comum de medição da densidade mede o peso de um volume conhecido de líquido num frasco, cujo volume é calibrado em termos do peso de água pura no mesmo frasco métodos por flutuação um corpo total ou parcialmente imerso num líquido flutua por uma força igual ao peso do líquido deslocado flutuação de um corpo mergulhador flutuação de um corpo flutuante (hidrometria) 12

13 25 d d V V hidrometria baseia-se no princípio de que o mesmo corpo desloca pesos iguais de qualquer líquido em que flutue volumes de diferentes líquidos deslocados pelo mesmo corpo flutuante são inversamente proporcionais às densidades dos líquidos 26 h D sen i sen r Refractometria índice de refracção razão entre a velocidade de radiação de uma frequência no vácuo e a velocidade de radiação da mesma frequência no meio considerado índice de refracção no ar e no vácuo diferem de apenas 0.03 % usa-se o ar como referência magnitude da refracção é uma característica de cada substância designada índice de refracção (h D ) 13

14 27 R 2 h x M h d índice de refracção padrão dado pela linha D da luz de sódio monocromática a 589 nm e a uma dada temperatura análise qualitativa cada átomo, ligação e grupo funcional contribui para o índice de refracção total de um composto índice de refracção específico soma das diversas contribuições refractividade molar índice de refracção específico multiplicado pelo peso molecular específica de cada composto 28 análise quantitativa índice de refracção de uma solução varia com a concentração do soluto varia linearmente quando concentração expressa em peso do soluto por volume de solução 14

15 29 Medida de ph ph = -log ah + em soluções diluídas (alimentos) considera-se actividade igual a [H + ] medido por eléctrodos um de medida e outro de referência, geralmente combinados 30 eléctrodo de vidro é o eléctrodo de medida mais usado em solução aquosa, os catiões da membrana de vidro permutam com H + formação de uma camada de sílica hidratada funciona como uma membrana de permuta catiónica, sensível a H + eléctrodo de Calomelanos geralmente usado como eléctrodo de referência 15

16 31 determinação da acidez acidez nos alimentos pode provir de: compostos naturais dos alimentos resultado de fermentações ou outro tipo de processamento ácidos adicionados durante o processamento deterioração do alimento principais ácidos encontrados nos alimentos cítrico, málico, oxálico, succínico e tartárico outros ácidos isocítrico, fumárico, oxalacético e cetoglutárico 32 acidez total titulável titulação usando um indicador ou um medidor de ph acidez volátil determinação pela separação dos ácidos voláteis presentes, principalmente ácido acético e traços de ácido fórmico separação feita por evaporação em banho- -maria, destilação directa e destilação a vapor destilado ou resíduo titulados com uma base padrão até o ponto final, usando um indicador (fenolftaleína) 16

17 33 Cromatografia escrever com cores introduzida em 1906 por Tswett E:\Bromatologia I\article Tswett.pdf componentes da amostra são distribuídos entre 2 fases, uma das quais estacionária, enquanto a outra flui através dessa cada componente da amostra será diferentemente retido pela fase estacionária devido a diversas interacções com esta adsorção à superfície solubilidade relativa carga 34 tipos de cromatografia CP cromatografia em papel CCD cromatografia em camada fina (TLC) CGL cromatografia gasosa líquida CGS cromatografia gasosa sólida CSS cromatografia supercrítica sólida CSFL cromatografia supercrítica de fase ligada CLL cromatografia líquida líquida CLS cromatografia líquida sólida CE cromatografia de exclusão CLFL cromatografia líquida de fasse ligada CTI cromatografia de permuta iónica CB cromatografia de bioafinidade 17

18 35 em função da polaridade das 2 fases, cromatografia pode ser de: fase normal fase estacionária polar e fase móvel apolar fase reversa fase estacionária apolar e fase móvel polar 36 transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária depende de: adsorção na superfície das partículas sólidas da fase estacionária partição entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte formação de ligações heteropolares com componentes iónicos da fase estacionária 18

19 37 separação dos componentes de uma mistura baseia-se no facto de que a velocidade de passagem de um soluto individual na fase estacionária depende da partição da molécula entre as 2 fases K coeficiente de partição C S - concentração do soluto na fase estacionária C m concentração do soluto na fase móvel K elevado significa que o soluto tem maior afinidade com a fase estacionária maior tempo de retenção 38 razão de retenção (R) dá a migração de uma substância em relação à fase móvel velo. soluto R velo. fase móvel fracção de tempo que as moléculas do soluto gastam na fase móvel em relação à fase estacionária cromatografia em papel e TLC usam-se distâncias de deslocamento R f factor de retenção R f distância percorrida pelo centro da zona do soluto distância percorrida pela frente do solvente R e R f não são constantes cromatográficas; dependem das condições cromatográficas impossível reproduzir valores obtidos por outros autores 19

20 39 tipos de desenvolvimento do cromatograma eluição mais utilizado em análise amostra introduzida numa extremidade do sistema adiciona-se um eluente componentes da mistura arrastados com diferentes velocidades função da afinidade relativa com as 2 fases 40 má separação pode dever-se a: coeficientes de partição muito próximos e pequenos componentes eluem todos ao mesmo tempo, praticamente junto com o eluente coeficiente de partição muito grande compostos ficam retidos muito tempo e separam mal separação pode melhorar por uso de gradientes variar tipo e concentração da fase móvel variar a pressão da fase móvel variar a temperatura da coluna 20

21 41 deslocamento utilizado em cromatografia preparativa deseja-se recuperar componentes da mistura componentes da amostra eliminados da fase estacionária usando uma fase móvel que é mais atraída por ela fase móvel liga-se à fase estacionária e desloca os componentes da mistura para seguirem livremente 42 análise frontal pouco utilizada passagem da amostra dissolvida num solvente através da fase estacionária sem aplicação de eluente componentes da amostra descem a coluna por gravidade usada para separação de um componente indesejável na amostra, que ficaria retido na fase estacionária, enquanto os outros componentes sairiam todos misturados 21

22 43 mecanismos de separação processos físicos processos de adsorção e absorção (partição) baseados principalmente em atracções electrostáticas ou dipolares (forças de Van der Waals), incluindo formação de pontes de H adsorção dá-se quando fase estacionária é um sólido e fase móvel gás ou líquidos em TLC, adsorção dá-se na interface entre sólido e fase móvel 44 absorção ou partição dá-se quando fase estacionária é um líquido espalhado na superfície de um suporte sólido inerte, ou aderido às paredes do tubo cromatográfico baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária líquida e na fase móvel também líquida dá-se na cromatografia em papel, na líquida-gasosa e na líquidalíquida 22

23 45 mecanismo misto entre a partição e a adsorção fase estacionária tem partes que actuam como adsorvente e outras como líquidos dá-se na cromatografia líquida de fase reversa 46 processo químico processo de permuta iónica fase estacionária constituída por uma matriz onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis permutadores aniónicos possuem sítios activos carregados positivamente, retendo aniões permutadores catiónicos possuem sítios carregados negativamente, retendo catiões fase móvel geralmente uma solução iónica tampão se a fase estacionária retém catiões, fase móvel deve conter catiões capazes de os substituir preferencialmente 23

24 47 processo mecânico cromatografia por exclusão fase estacionária é uma matriz inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade uniformes moléculas da amostra separadas por tamanho menores penetram facilmente os poros da fase estacionária maiores excluídas de todos os poros moléculas intermédias penetram selectivamente nos poros, entrando em apenas alguns, saindo da coluna em ordem relacionada com o seu tamanho efectivo moléculas maiores saem primeiro da coluna 48 nomenclatura cromatograma gráfico demonstrativo da separação obtida cromatografia planar cromatografia em coluna áreas dos picos proporcionais às concentrações tempo de retenção efectivo - tempo em que as moléculas ficam retidas na fase estacionária t M (tempo morto) tempo gasto pelo soluto não retido a atravessar a coluna volume da fase móvel necessário para eluir um componente F fluxo da fase móvel V M (volume morto) volume de fase móvel gasto para eluir um componente não retido Volume total dentro da coluna V e volume da fase estacionária t t t ' r r M V V r M t F r t F M V V V t M e 24

25 49 na cromatografia em coluna, a retenção de um componente é dada pelo factor de retenção (k) t k t t m tempo em que as moléculas percorrem a coluna na fase móvel quantificação feita por medida das áreas dos picos ' r m 50 eficiência da separação separação entre 2 picos adjacentes medida por: factor de separação (a) razão entre os respectivos factores de retenção k a k resolução (R) razão entre a diferença dos tempos de retenção entre 2 picos adjacentes e a média das suas larguras na linha de base R S t r t r l b 2 1 l b 1 2 medida da largura na linha de base faz-se traçando tangentes nos lados dos picos 25

26 51 A fase móvel eficiência de uma coluna cromatográfica nº de pratos teóricos (N) prato teórico é o equilíbrio de distribuição do soluto entre a fase móvel e a estacionária quanto maior o nº de pratos teóricos, mais eficaz a separação, devido a maior número de equilíbrios Ý A fase estacionária 2 2 d d r r n l l b h/2 n nº de pratos teóricos l h/2 largura do pico a meia-altura usa-se quando pico mal definido e não se podem traçar as tangentes 52 descontando a distância do tempo morto obtém-se o nº de pratos teóricos efectivos (N) 2 2 ' dr ' dr N l l b h/2 N varia com: tempo de retenção comprimento e diâmetro da coluna tipo de soluto fluxo da fase móvel tamanho da amostra técnica de injecção temperatura 26

27 53 altura equivalente de um prato teórico (H) razão entre o comprimento total da coluna (L) e o nº equivalente de pratos teóricos quanto maior o valor de N e menor o de H, maior a eficácia da coluna H L N 54 B H A Cm m equação de van Deemter (teoria da velocidade) relaciona o valor da altura equivalente do prato teórico com a velocidade linear (m) da fase móvel e factores que causam alargamento das bandas dos compostos ou dos picos dos cromatogramas alargamento dá-se porque as moléculas do soluto não se deslocam simultaneamente na fase estacionária A efeito dos múltiplos caminhos relacionado com o empacotamento da coluna B difusão molecular do soluto na fase móvel apenas relevante em GC C resistência à transferência de massa das moléculas do soluto da fase estacionária para a móvel mais importante na LC 27

28 55 A B 56 pretende-se encontrar H min para uma eficácia óptima da coluna A é uma constante, B diminui e C aumenta com o aumento do fluxo da fase móvel utilização de colunas de diâmetro interno pequeno e suportes sólidos de tamanho pequeno e uniforme diminui A aumentar densidade do gás de arrasto diminui B diminuir espessura e viscosidade do filme líquido da fase estacionária diminui C 28

29 57 curvas de van Deemter Colunas capilares 58 análise qualitativa cromatografia não permite identificar um composto indica a presença de uma substância mas não a identifica em certas condições, é possível comparar tempo de retenção com o de um padrão padrão deve ser uma parte da amostra ou adicionado a ela (padrão interno) deve eluir aproximadamente a meio da análise amostra deve ser pequena valores razoavelmente constantes ao longo de diversas corridas 29

30 59 análise quantitativa detectores produzem uma resposta por unidade de concentração dependente da substância, pelo que deve sempre usar-se um padrão requer picos razoavelmente bem resolvidos área do pico proporcional à concentração 60 método do padrão externo solução padrão contendo todos os analitos a quantificar padrões devem ter concentrações semelhantes às dos componentes da amostra padrão e matriz da amostra devem ser semelhantes condições analíticas devem ser idênticas área área desconhecida conc = conc desconhecida padrão padrão 30

31 61 método do padrão interno substância conhecida adicionada em concentração constante a todas as amostras tem em conta variações durante a análise deve ser estável e mensurável nas condições analíticas utilizadas não deve interferir na análise nem coeluir com componentes da amostra área padrão int.1 desconhecido conc = conc desconhecida padrão área padrão int.2 área área padrão 62 Cromatografia em papel cromatografia líquido-líquido separação ocorre por partição do soluto entre 2 líquidos componentes menos solúveis na fase estacionária movem-se mais rapidamente ao longo do papel, mais solúveis retidos no papel, movendo-se mais lentamente simples e barata pequena quantidade de amostra boa capacidade de resolução prática 31

32 63 mecanismo de separação líquidos polares (como H 2 O) têm grande afinidade pelos grupos OH da celulose do papel, formando pontes de H líquido retido funciona como fase estacionária líquidos menos polares (solventes orgânicos) são repelidos funcionam como fase móvel 64 aplicação da amostra amostra preferencialmente dissolvida num líquido volátil aplicada com um capilar mancha pode ser detectada por: métodos químicos reveladores químicos que tornam as manchas coloridas métodos físicos fluorescência de algumas substâncias 32

33 65 análise/identificação mede-se a distância percorrida pelo soluto num tempo determinado, desde o ponto de aplicação da amostra até ao centro da mancha mede-se a distância percorrida pela fase móvel, desde o ponto de partida até à linha de chegada distância percorrida pela substância Rf distância percorrida pela frente da fase móvel pode fazer-se a extracção dos componentes separados no papel com um solvente adequado método instrumental para quantificar o componente isolado espectrofotometria 66 tipos de desenvolvimento ascendente mais simples e comum descendente manchas colocadas na parte de cima do papel papel colocado numa cuba com solvente solvente desce por capilaridade e gravidade mais rápida, mas necessita de equipamento mais complexo horizontal (circular) solvente colocado no centro do papel e a amostra em volta separação dá-se de modo circular bidimensional fase móvel desloca-se ascendentemente de seguida roda-se o papel 90º e faz-se novo deslocamento ascendente 33

34 67 eficiência de separação concentrações muito elevadas provocam formação de cauda, devido a movimentação do soluto de regiões de maior concentração para regiões de menor concentração se solutos e fase móvel percorrem distâncias diferentes difusão lateral se o fluxo for muito rápido, não há um tempo ideal de contacto entre a fase móvel e a fase estacionária depende da composição da fase móvel 68 Cromatografia em camada fina (TLC) separação dos componentes de uma mistura por migração diferencial sobre uma camada fina de adsorvente preso sobre uma superfície plana superfície de vidro ou alumínio 34

35 69 vantagens: fácil execução rapidez versatilidade grande reprodutibilidade baixo custo, embora mais cara que cromatografia em papel aplicação analítica ou preparativa separação mais rápida e eficaz que na cromatografia em papel permite utilização de agentes de revelação corrosivos mais sensível e requer menor quantidade de amostra que cromatografia em papel mais versátil em relação à fase estacionária que cromatografia em papel 70 desvantagens: maior dificuldade de retirar as manchas da placa para análise por outros métodos que na cromatografia em papel menor uniformidade para fazer a camada fina 35

36 71 separação baseada na adsorção soluto separado entre fase estacionária sólida e fase móvel líquida podem existir fases estacionárias que permitem separação por partição ou permuta iónica 72 detecção feita com reagentes cromogénicos convencionais ou por uso de radiação UV identificação feita com padrões quantificação feita por raspagem da placa, seguida por dissolução em solvente e análise em espectrofotómetro 36

37 73 Cromatografia em camada fina de alta eficiência (HPTLC) diferentes adsorventes utilizados como fase estacionária aumento da eficiência de separação relativamente à TLC clássica Parâmetros TLC HPTLC Tamanho habitual da placa 20x20 cm 10x10 cm Volume aplicado de cada amostra 1 5 ml ml Nº de amostras por placa Diâmetro da mancha 3 6 mm 1 mm Distância de migração do solvente cm 3 6 cm Tempo de corrida min 3 20 min Diâmetro médio da partícula de sílica gel 20 mm 5 mm Limites de detecção por absorção de luz ~5 ng ~0.5 ng por fluorescência ~0.1 ng ~0.1 ng Pratos teóricos até 600 até Cromatografia líquida em coluna aberta dividida em 4 partes de acordo com o mecanismo de separação cromatografia de adsorção cromatografia de partição cromatografia de exclusão molecular filtração permeação em gel cromatografia de permuta iónica 37

38 75 cromatografia de adsorção (líquida-sólida) fase estacionária é um sólido de superfície activa sílica gel, alumina, celulose,... sólido empacotado dentro da coluna de vidro ou de aço fase móvel é um solvente composto de um ou mais líquidos orgânicos elui os componentes da amostra através da coluna fase normal fase estacionária é polar; fase móvel apolar fase reversa fase estacionária é apolar; fase móvel polar 76 separação resulta da diferente adsorção dos componentes da amostra sobre a superfície do sólido (fase estacionária) solutos fracamente adsorvidos caminham mais rapidamente solutos mais fortemente adsorvidos são retardados interacções moleculares envolvidas na adsorção: pontes de H forças electrostáticas (van der Waals) forças de transferência de carga... 38

39 77 funções dos eluentes: dissolver componentes da amostra eluir componentes da amostra pela coluna desvantagem da técnica: produz cauda (tailing) ou alargamento da banda (efeito de difusão) prejudica separação 2 tipos de cromatografia de adsorção em coluna: convencional, à pressão atmosférica coluna de vidro amostra colocada no topo de uma coluna de vidro empacotada com um adsorvente eluição com um solvente, à pressão atmosférica recolha na saída da coluna, a tempos ou volumes constantes fracções recolhidas analisadas por: métodos físicos fluorescência, absorção electrónica, ph, actividade óptica, índice de refracção,... métodos químicos adição de um reagente que produza um composto colorido ou fluorescente 78 39

40 79 HPLC, a pressão elevada coluna de aço estreita separação mais rápida além da separação, permite a identificação e quantificação através de detectores e processadores 80 cromatografia de partição (líquida-líquida) coluna empacotada com um suporte sólido de grande área superficial embebido com uma fase líquida amostra aplicada no topo da coluna eluída com fase móvel líquida imiscível com a fase estacionária separação devida a migração mais lenta de solutos relativamente mais solúveis na fase líquida estacionária, relativamente à dos solutos com maior solubilidade relativa na fase móvel líquida solutos são sempre mais solúveis na fase estacionária que na fase móvel 40

41 81 cromatografia de partição normal (ex.) para separar uma mistura polar, usa-se um líquido polar (H 2 O) como fase estacionária e um líquido menos polar (solvente orgânico) como fase móvel cromatografia de partição de fase reversa (ex.) solutos não polares separados numa fase estacionária menos polar (óleo mineral) com uma fase móvel mais polar (metanol) 82 forças intermoleculares envolvidas na partição: pontes de H forças de dipolos induzidos forças de dispersão forças de interacção específica 41

42 83 cromatografia líquida de permuta iónica coluna empacotada com uma fase estacionária sólida contendo grupos iónicos grupos iónicos podem trocar reversivelmente catiões ou aniões com uma solução iónica separação dá-se por troca de iões entre os solutos da amostra e os componentes iónicos das fases móvel e estacionária 84 amostra colocada no topo da coluna e eluída com uma fase líquida iónica iões da amostra são atraídos para a fase estacionária por forças electrostáticas arrastados pelo eluente, por troca de lugar velocidades de arrastamento dependem da sua afinidade relativa para com a resina os mais atraídos pela resina movem-se mais devagar regras de selectividade do permutador iónico: prefere iões com maior carga prefere iões de menor tamanho prefere iões altamente polarizáveis prefere iões com fracas interacções com a fase móvel 42

43 85 fase móvel é um líquido ou mistura de líquidos com cargas iónicas do mesmo sinal que os solutos da amostra, mas com maior força iónica solução ácida, básica ou tampão fase estacionária é um material poroso, inerte, insolúvel em água e em solventes orgânicos possui grupos permutadores iónicos ligados covalentemente natural ou sintética orgânica ou inorgânica também existe a cromatografia de permuta iónica de alta eficiência fase móvel a pressão elevada 86 cromatografia líquida de exclusão molecular (permeação em gel) componentes da amostra não possuem afinidade nem com a fase móvel nem com a estacionária separados por selecção de tamanho das moléculas, através da fase estacionária fase móvel apenas dissolve e arrasta os componentes da amostra moléculas menores penetram no interior da fase estacionária, sendo retardadas relativamente às moléculas maiores, as quais percorrem trajectos mais curtos (pelo exterior das partículas da fase estacionária) 43

44 87 vantagens: simplicidade técnica insensibilidade a solventes e temperatura condições suaves versatilidade 88 fase estacionária pode ser um gel hidrofílico e a fase móvel um solvente aquoso salino alternativamente, um gel hidrofóbico e um solvente orgânico características da fase estacionária: inércia química evitar ligação irreversível entre fase estacionária e componentes da amostra estabilidade permitir uso contínuo quando mantida em condições moderadas de ph e temperatura 44

45 89 cromatografia líquida de bioafinidade mais utilizada na área da farmácia que na dos alimentos macromoléculas biológicas ligam-se reversivelmente a ligantes específicos fase estacionária constituída por um suporte sólido inerte onde estão presos os ligantes fase móvel formada por soluções com diversos valores de ph ou força iónica (tornam instável ligação por bioafinidade) ou com substâncias que possuem maior afinidade pelo ligante do que o componente da amostra 90 escolha do solvente em LC 1º - determinar se vamos trabalhar em fase normal ou fase reversa se a amostra for não polar ou insolúvel em água usar fase normal se a amostra for solúvel em água ou não solúvel mas polar usar fase reversa frequentemente tem que se usar uma mistura de solventes tirar partido de diferentes polaridades e propriedades de solvente polaridade determina tempo de retenção dos eluentes selectividade do solvente determina a retenção relativa; pode afectar forma dos picos 45

46 91 92 alguns solventes não podem ser usados por: não serem quimicamente inertes possuirem absorção no UV ou viscosidade elevadas serem tóxicos ou inflamáveis possuirem pressão de vapor elevada serem demasiado caros serem pouco miscíveis 46

47 93 eluição com gradientes permite variar a polaridade e melhorar a separação redução no tempo de análise picos melhor formados maior sensibilidade pode provocar deriva na linha de base 94 tipos de cromatografia líquida compatíveis com uso de gradientes: permuta iónica fase ligada adsorção 47

48 95 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) optimização da cromatografia em coluna solvente atravessa a coluna a pressão elevada separação mais rápida e eficiente fase móvel é um líquido fase estacionária pode ser sólida (mais comum) ou líquida Coluna clássica Depende da experiência do analista Fase estacionária menos durável Detecção demorada e manual Barata HPLC Maiores resolução, sensibilidade e reprodutibilidade Maior rapidez e automação Equipamento, operação e manutenção mais caras 96 vantagens de HPLC em comparação com GC GC Técnica e equipamento mais baratos Menor tempo de análise Maior sensibilidade (10-12 g) Maior capacidade analítica (pode separar até 200 componentes) Menor tempo de formação técnica HPLC Analisa amostras não voláteis e termicamente instáveis Amostras com maior variedade de peso molecular Maior variedade de aplicação Ambas as fases têm afinidade com os componentes da amostra Maior versatilidade Maior diversidade de mecanismos de separação 48

49 97 98 componentes de um equipamento de HPLC reservatório da fase móvel resistente aos líquidos usados como fase móvel aço, vidro, plástico inerte fase móvel deve ser filtrada e desgaseificada evitar entupimento e entrada de gases no equipamento gases provocam aparecimento de picos no cromatograma e podem alterar a fase móvel e degradar a fase estacionária desgaseificação feita por: ultra-sons, aquecimento, vácuo, refluxo 49

50 99 componentes de um equipamento de HPLC bombas de pressão elevada garantem fluxo constante reprodutibilidade, sensibilidade e resolução medidores de pressão permitem verificar existência de problemas entupimento aumenta pressão vazamento baixa pressão pressão influenciada por: viscosidade da fase móvel dimensões da coluna diâmetro das partículas da fase estacionária empacotamento da coluna 100 componentes de um equipamento de HPLC injectores devem ser: reprodutíveis permitir diversos volumes de injecção ml tipos de injector: micro-seringa válvula rotatória gira de modo a que a fase móvel se ligue com o loop da amostra, arrastando-a para dentro da coluna a pressão elevada 50

51 101 actualmente pouco utilizadas, pois fase móvel é filtrada e fases estacionárias mais resistentes componentes de um equipamento de HPLC colunas 3 tipos pré-colunas colocadas entre a bomba e o injector para: reter impurezas da fase móvel e preservar a coluna analítica saturar a fase móvel com o líquido da fase estacionária em cromatografia líquidalíquida (evitar que se misturem, destruindo o enchimento da coluna analítica) 102 componentes de um equipamento de HPLC colunas de guarda colocadas entre o injector e a coluna analítica mais curtas mas com mesmo diâmetro e fase estacionária que as colunas analíticas retêm impurezas da amostra renovação frequente necessária colunas analíticas responsáveis pela separação feitas de materiais inertes aço, vidro reforçado, sílica fundida diâmetro interno uniforme resistentes à fase móvel e pressão elevada 51

52 103 componentes de um equipamento de HPLC detectores medem, de forma contínua, uma propriedade física dos componentes da amostra enviam um sinal eléctrico que será registado como um pico tipo de detector usado depende dos compostos a analisar requisitos: alta sensibilidade eficiente detecção mínima baixo nível de ruído largo intervalo de linearidade elevada estabilidade boa repetibilidade 104 componentes de um equipamento de HPLC sensibilidade relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera o sinal alta sensibilidade grande resposta para um dado componente da amostra detecção mínima mínima quantidade do composto que pode ser detectada quantidade que gera um sinal 2 vezes superior ao ruído de fundo ruído de fundo variação do sinal do detector, devida a variações eléctricas, de fluxo, de temperatura, bolhas de ar, 52

53 105 componentes de um equipamento de HPLC linearidade proporcionalidade entre a resposta quantitativa do detector e a concentração do composto detectado verificada através de uma recta padrão que relaciona área do pico com diversas concentrações de um composto padrão estabilidade relativamente a variações de fluxo e composição da fase móvel 106 componentes de um equipamento de HPLC repetibilidade capacidade do detector manter uma resposta constante para mais que uma injecção da mesma amostra, tanto qualitativa como quantitativamente 53

54 107 componentes de um equipamento de HPLC tipos de detector universal responde a qualquer tipo de amostra (índice de refracção) selectivo responde a uma propriedade do soluto (absorção electrónica) específico responde a um único tipo de amostra (fluorescência) 108 componentes de um equipamento de HPLC detector de absorção electrónica sensível e capaz de detectar grande nº de compostos detector de absorção electrónica por vector de díodos permite obtenção do espectro de absorção do composto a ser separado ajuda à identificação detector por índice de refracção mais universal sensibilidade e reprodutibilidade muito baixas variação com composição da fase móvel, temperatura e pressão não permite utilização de gradientes 54

55 109 componentes de um equipamento de HPLC detector de absorção no infravermelho pouco utilizado, devido à baixa sensibilidade apenas eficaz em cromatografia de exclusão molecular (maior quantidade de amostra) detector de fluorescência limitado a compostos com capacidade de fluorescer, ou que foram derivatizados para tal elevadas sensibilidade e especificidade 110 componentes de um equipamento de HPLC detectores electroquímicos constante dieléctrica mede variação de polaridade na fase móvel amperométricos medem capacidade de oxidar ou reduzir um composto mais usado dos detectores electroquímicos condutimétricos medem condutividade do solvente usados em soluções de iões polarográficos potenciométricos 55

56 111 componentes de um equipamento de HPLC registadores integrador ou computador identificação e quantificação de cada pico 112 tipos de fase móvel em HPLC escolha baseada na afinidade entre os componentes da amostra e os solventes polaridade requisitos alto grau de pureza dissolver a amostra sem decompor os seus componentes não dissolver ou decompor a fase estacionária ter baixa viscosidade ser compatível com o detector utilizado ter disponibilidade e baixo custo não ser tóxica nem inflamável 56

57 113 tipos de fase estacionária em HPLC características: elevada resolução entre os componentes da amostra fácil introdução na coluna pequena queda de pressão diâmetro uniforme partículas porosas ou peliculares quanto menor a partícula, maior a eficiência da separação melhor difusão dos componentes da amostra eficiência aumenta com regularidade das partículas 114 Cromatografia gasosa (GC) fase móvel é um gás inerte, apenas serve para transportar componentes da amostra através da coluna fase estacionária pode ser um sólido (cromatografia sólido-gasosa) ou um líquido (cromatografia líquido-gasosa) separação dá-se por adsorção no sólido na GSC e por partição na GLC na GSC, fase estacionária é um sólido de grande área superficial na GLC, fase estacionária é um líquido que fica preso na coluna através de um suporte sólido inerte ou por capilaridade 57

58 115 Vantagens GC Rapidez fase móvel gasosa tem maior velocidade; equilíbrio entre solutos e as 2 fases mais rápido Alto poder de resolução e separação fase móvel tem baixa resistência ao fluxo (colunas longas, com grande nº de pratos teóricos) Elevada sensibilidade Requer pequenas quantidades de amostra Desvantagens GC Analisa apenas componentes voláteis, ou que se tornam voláteis após derivatizados Preparação da amostra pode ser trabalhosa aumenta o tempo de análise Necessita de técnicas complementares para identificação de componentes Não é uma boa técnica preparativa 116 amostra pode ser um gás ou líquido volátil injectada através de micro-seringa ou injector automático aquecida e vaporizada no injector do cromatógrafo arrastada pela fase móvel para a coluna que contém a fase estacionária coluna aquecida para manter amostra vaporizada 58

59 117 componentes da amostra selectivamente retardados pela fase estacionária componentes em equilíbrio com ambas as fases equilíbrio curto devido à chegada de mais gás de arrasto componentes dissolvidos deixam a fase líquida para restaurar o equilíbrio componente completamente removido da secção da fase estacionária mais moléculas do componente deixam a fase gasosa dissolvendo-se na fase líquida atinge novo equilíbrio fase gasosa puxa novamente os componentes, destruindo o equilíbrio processo repetido muitas vezes 118 velocidade de movimentação dos componentes na coluna depende de: solubilidade na fase estacionária volatilidade para a fase móvel separação dada pela maior ou menor retenção na fase estacionária adsorção pelo suporte sólido também pode influenciar separação após separação, componentes da amostra entram num detector registador capta sinais do detector cromatograma 59

60 características de um cromatograma: primeiros picos mais agudos e simétricos que os últimos quanto maior o tempo de retenção, maior o alargamento da banda podem aparecer picos não completamente separados separação melhora por aumento do comprimento da coluna picos podem ter assimetria frontal ou caudal frontal causada por injecção de amostra em excesso ou temperatura da coluna inferior à ideal caudal aparece devido a defeito na injecção ou a adsorção excessiva da amostra na fase estacionária ou suporte sólido análise pode ser isotérmica ou por gradiente de temperatura gradiente melhora a separação e reduz tempo de análise picos melhor separados redução do tempo de retenção dos compostos com maior ponto de ebulição picos mais simétricos linha de base tende a subir com aumento de temperatura 60

61 121 características do gás de arraste inerte não interagir nem com a fase estacionária nem com amostra compatível com o detector mínima difusão gasosa disponível, barato e seguro pureza elevada coloca-se um filtro entre o cilindro de gás e o aparelho peneira molecular que retira água e hidrocarbonetos gases mais utilizados: azoto (mais barato) hélio (elevada condutividade térmica) hidrogénio (inflamável) 122 fluxo do gás de arraste tem que ser controlado e mantido constante durante a análise reprodutibilidade dos tempos de retenção e quantificação 61

62 123 injector vaporização rápida e completa da amostra (geralmente líquida) não decompor nem fraccionar a amostra tipos de injector: por seringa de split de splitless cold-on column 124 tipos de injector por seringa usada em colunas empacotadas volume de injecção entre ml em amostras voláteis, solvente e compostos mais voláteis podem sair da seringa antes dos menos voláteis modifica composição original da amostra 62

63 125 tipos de injector de split usada em colunas capilares e de sílica fundida pequenos diâmetros e longas injector faz a vaporização da amostra, enquanto ela é misturada com o gás de arrasto apenas uma pequena fracção da amostra entra na coluna (split) restante sai para fora do equipamento 126 requisitos: mínimo alargamento da banda fora da coluna inerte larga faixa de operação nas razões do split mínima contaminação divisão da amostra linear e reprodutível operação em larga gama de temperaturas selecção da temperatura do injector, velocidade de injecção e razão do split dependem do tipo de amostra 63

64 127 tipos de injector de splitless possui uma válvula que pode ser fechada por um período de tempo (30 90 s) quando a amostra está a ser injectada, vaporizada e transferida para a coluna cerca de 95 % da amostra entra na coluna durante esse período restante eliminado pelo split aplica-se a: soluções muito diluídas componentes que saem na cauda do solvente compostos termolábeis 128 amostra injectada em grande volume e lentamente temperatura da coluna cerca de 20 ºC inferior ao ponto de ebulição do solvente da amostra solvente condensa no início da coluna, retendo os componentes da amostra gás de arrasto vai evaporando o solvente (mais volátil) e concentrando a amostra programa de temperatura vaporiza imediatamente o solvente componentes da amostra concentrados para a análise 64

65 129 tipos de injector cold-on column amostra directamente injectada na coluna por uma seringa sem pré-aquecimento nem mistura com o gás de arrasto agulha da seringa tem diâmetro muito estreito, para poder entrar na coluna capilar, através de um septo vantagens: maior exactidão com compostos muito voláteis excelente quantificação de componentes individuais da amostra diminuição da decomposição térmica da amostra 130 coluna 2 tipos de coluna: empacotada tipos de empacotamento: adsorvente sólido (GSC) fase líquida adsorvida num suporte sólido (GLC) fase líquida ligada quimicamente a um suporte sólido (GLC) metálica ou de vidro características do suporte sólido: grande área superficial diâmetro uniforme dos poros inércia química forma regular resistência mecânica preço acessível 65

66 131 características das fases estacionárias líquidas: apolares, polaridades altas ou baixas dissolver bem os solutos da amostra grande resolução dos solutos da amostra nas condições de tempo e temperatura seleccionadas não ser volátil na temperatura máxima de utilização termicamente estável quimicamente inerte 132 sangramento parte da fase estacionária arrastada com a fase móvel características das fases estacionárias líquidas: pode ocorrer sangramento se for ultrapassado o limite máximo da temperatura fase estacionária vai contaminar o detector (diminui sensibilidade) subida na linha de base fase estacionária perde solubilidade se temperatura estiver abaixo do mínimo 66

67 133 coluna capilar maiores e com maior nº de pratos teóricos não têm suporte sólido fase estacionária líquida adere às paredes da coluna por capilaridade tubo externo de níquel, aço, vidro ou sílica fundida inerte elevada pureza muito flexível 134 coluna problemas comuns: alta velocidade do gás de arrasto pode deslocar filme da coluna perda de fase estacionária por volatilização sangramento presença de impurezas oxigénio e água na fase móvel podem decompor a fase estacionária 67

68

69 detectores características: rapidez detecção deve ser feita em alguns segundos alta sensibilidade quantidade mínima detectável deve ser 2 vezes o ruído de fundo baixo nível de ruído linha de base deve ser constante ampla faixa de resposta linear linearmente proporcional à concentração de soluto só ocorre a baixas concentrações selectividade detectores universais detectores selectivos (mais sensíveis) não destrutivo alguns detectores destroem a amostra detectores tipos de detectores: condutividade térmica (TCD) mede a capacidade de remover calor de um objecto quente responde à condutividade térmica do gás que o atravessa Vantagens Universal Não destrói a amostra Desvantagens Menos sensível que os outros Requer temperatura e velocidade do gás de arrasto constantes não pode ser usado com gradiente 69

70 139 detectores ionização de chama (FID) responde a qualquer substância que ao queimar forme um composto com carga eléctrica maioria dos compostos orgânicos; não o gás de arrasto Vantagens Mais sensível que TCD Não sensível a variações de temperatura nem de velocidade do gás de arrasto permite uso de gradiente Ampla faixa linear (adequado para análise quantitativa) Desvantagens Destrói a amostra Resposta diferencial 2 compostos com mesma concentração podem dar respostas diferentes (requer factor de correcção, para quantificar) 140 detectores captura electrónica (ECD) baseado na capacidade de certos compostos em capturar electrões livres Vantagens Muito sensível a compostos capazes de capturar electrões compostos com átomos electronegativos [O 2, N 2, S 2 e halogénios (pesticidas)] Altamente selectivo não detecta hidrocarbonetos, álcoois, cetonas, Desvantagens Destrói a amostra Necessita limpeza constante facilmente contaminado pela amostra Faixa linear limitada problemas na análise quantitativa 70

71 141 termostatos controlam as temperaturas no injector, detector e coluna temperatura de injecção ideal para vaporizar totalmente a amostra sem causar reacções indesejáveis temperatura do detector suficientemente alta para evitar condensação da amostra, da fase líquida proveniente de sangramento e de impurezas no gás de arrasto 142 termostatos temperatura na coluna não deve exceder o limite da fase estacionária líquida (pode ocorrer sangramento) se temperatura muito alta, compostos não interagem com fase estacionária (má separação) se temperatura muito baixa, aumenta interacção com fase estacionária, mas análise muito longa 71

72 143 registadores simples registam apenas o cromatograma integradores registam e quantificam os picos computador registam e quantificam de modo automatizado 144 identificação baseada no tempo de retenção t r depende de: tamanho da coluna % da fase estacionária temperatura da coluna velocidade do gás de arrasto tempo de retenção efectivo t t t ' r r 0 t 0 tempo morto 72

73 145 t rr tr t identificação tempo de retenção relativo retenção do composto em relação a um composto de referência composto de referência injectado separadamente da amostra tira-se o tempo de retenção trpadrão relativo dos t componentes da rreferência amostra e dos padrões co-cromatografia (spiking) misturar um composto padrão à amostra antes da injecção identificação não é conclusiva, mas permite excluir confirmação por outros métodos analíticos desconhecido r referência 146 quantificação cálculo da área do pico por triangulação triangulação com altura total triangulação a meia altura método mais exacto A h l elimina erro da largura de picos assimétricos x h /2 l x h b A 2 73

74 quantificação normalização interna percentagem relativa de cada pico em relação à composição total da amostra todos os componentes da amostra devem ser eluídos e ter a mesma resposta no detector área A % A x 100 área total 74

75 quantificação normalização da área corrigida com o factor de resposta quando compostos não têm mesma resposta no detector corrigir com factor de resposta injectar uma mistura de concentração conhecida nas substâncias cujos factores se % A f A % A conhecida observada quer determinar relacionar a percentagem conhecida e observada calcular % da substância presente na amostra multiplicando área obtida pelo factor de resposta e dividindo pelo somatório de todas as áreas multiplicadas pelos respectivos factores de resposta quantificação padrão externo compara área da substância de concentração desconhecida com área da mesma substância em soluções padrão com concentração conhecida amostra e mistura de padrões injectadas separadamente possibilidade de erro na injecção das soluções e preparação dos padrões 75

76 151 quantificação padrão interno adição de concentrações conhecidas de uma substância padrão à amostra, antes da injecção área de cada pico da amostra relacionada com área da substância padrão padrão interno deve ser: similar à substância analisada e ter um t r próximo (mas diferente) inerte não fazer parte da composição da amostra método menos sensível a erros de injecção 152 quantificação adição de padrão adição de quantidades conhecidas do padrão da substância a ser analisada a quantidades conhecidas da amostra traça-se um gráfico com a melhor recta que passe pelos pontos experimentais, prolongando-se até ao eixo dos x concentração de cada pico da amostra medido desde a intersecção até ao ponto x=0 método utilizado em amostras que ainda contenham interferentes interferentes estarão presentes tanto na amostra como no padrão 76

77 153 derivatização necessária para tornar amostras analisáveis em GC alquilação esterificação

78 155 Cromatografia com fluídos supercríticos (SFC) técnica complementar das cromatografias líquida e gasosa utiliza fluídos supercríticos gás aquecido a uma temperatura superior à crítica e comprimido a uma pressão superior à crítica fluído denso viscosidade similar aos gases e 100 vezes menor que líquidos coeficiente de difusão maior que líquidos e menor que gases poder de solubilidade maior que gases e semelhante a líquidos 156 usada para separar: amostras termicamente instáveis amostras de mais elevado peso molecular que em GC mais eficiente e rápido que HPLC principal desvantagem poucos equipamentos e caros 78

79 157 Métodos hifenados combinação de métodos cromatográficos com espectrométricos GC-MS GC-FTIR GC-AES LC-MS 158 Espectrometria de massa (MS) interface é um dos pontos críticos transferência quantitativa do analito redução do fluxo/pressão proveniente do cromatógrafo para um nível compatível com espectrómetro preço acessível nenhuma interface obedece a todos os requisitos 79

80 159 Espectrometria de massa (MS) opção mais simples é a divisão do fluxo permite entrada no MS mas perde-se amostra mais fácil interface em GC que em LC tipos de interface separador molecular divisão aberta (open split) capilaridade directa 160 Espectrometria de massa (MS) separador molecular mais usado com colunas de empacotamento moléculas maiores difundem mais lentamente e entram em maior nº no MS open split usado com colunas capilares e fluxos ~1 ml/min MS puxa ~1 ml/min através do restritor 80

81 161 Espectrometria de massa (MS) capilaridade directa funciona com colunas capilares simples, barato e não selectivo não há volume morto limita a gama de fluxos usada pela coluna limita diâmetro interno da coluna parte da coluna é perdida (usada como restritor de fluxo) 162 Espectrometria de massa (MS) GC-MS 2 possibilidades de operação varrimento recolha de dados numa dada gama informação qualitativa monitorização de ião individual (SIM) valores de massa pré-determinados informação quantitativa 81

82 163 Espectrometria de massa (MS) GC-MS para maximizar informação quantitativa e qualitativa: fazer várias corridas procurar compostos alvo 164 qualificação baseada em: tempo de retenção iões encontrados razões entre iões padrão interno Espectrometria de massa (MS) procurar compostos alvo funciona melhor se se estiver a analisar um nº limitado de compostos requer um padrão interno marcado com um isótopo para cada composto identificam- -se,pelo menos, 3 linhas do espectro maior quantificação 2 ou mais iões qualificadores, bem resolvidos adiciona-se padrão interno à amostra análise SIM às 6 linhas 82