Linhas de orientação e princípios gerais de utilização e marcação do LC-MS

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1 Linhas de orientação e princípios gerais de utilização e marcação do LC-MS 1 - O equipamento tem um técnico responsável pela gestão corrente do equipamento e pelo apoio técnico. 2 - O equipamento tem uma ficha de utilização. 3 - Dada a diversidade de grupos interessados na partilha do equipamento, o que implica a necessidade de optimização das condições de análise para cada grupo, prevê-se que os grupo possam necessitar de utilizar o aparelho de HPLC/MS por períodos não inferiores a uma semana de utilização contínua. Em algumas situações pode tornar-se necessária a utilização do aparelho por um período superior a uma semana para que um determinado trabalho possa ser desenvolvido sem o consequente prejuízo de interrupção na obtenção de resultados (quer a nível da necessidade de obtenção de resultados científicos, quer a nível de rentabilização do aparelho que foi optimizado para um dado objectivo), não devendo contudo este período exceder um mês de utilização contínua. Neste processo, os outros grupos somam créditos de tempo de utilização para ciclos seguintes. 4 - Cada grupo deverá comparticipar nas despesas de manutenção do equipamento de acordo com tempo de utilização observado na folha de registo. 5 - O acesso dos diferentes investigadores dos centros que apoiaram a aquisição do equipamento é livre dentro dos parâmetros anteriormente definidos, cabendo ao técnico a gestão da utilização do equipamento. 1 Desenvolvimento do método LC No sentido de rentabilizar a utilização do LC-MS, a parte do método de análise por cromatografia líquida (LC) terá que ser previamente desenvolvida por cada grupo. As condições de análise estabelecidas serão as utilizadas no LC ligado ao MS. Deste modo, no desenvolvimento do método de LC, recomenda-se o seguinte: a) Solventes Devem ser utilizados solventes orgânicos para LC com qualidade gradient grade. Utilizamos normalmente os da Merck, LiChrosolv gradient grade for liquid chromatography. A água deve ser Millipore. Recomenda-se a filtragem do sistema eluente para eliminar partículas em suspensão e/ou não dissolvidas. Este passo é particularmente importante para o caso de serem utilizados aditivos (compostos ionizantes, sais, soluções tampão etc.). O ideal será a filtragem sob vácuo, que permite eliminar ainda parte do ar dissolvido. Pode ser utilizado um kit Sartorios, por exemplo.

2 É vulgar adicionar agentes ionizantes aos solventes. No modo de ionização positiva por Electro-Spray (ESI), o que vamos testar em primeiro lugar, pode utilizar-se o ácido fórmico numa proporção de 0,1 %. No modo negativo por utilizar-se o acetato de amónio com concentração 2mM. b) Coluna O método deve ser desenvolvido com a coluna que vai ser usada no LC do MS. No modo ESI, o fluxo varia normalmente entre 0,3 e 0,5 ml/min. Recomenda-se assim a utilização de colunas com diâmetro interno de cerca de 2,1 mm, que permitem também menor consumo de solventes. Um exemplo de coluna para pesticidas é a seguinte: Purospher STAR (Merck) LiChroCART (12,5 cm de comprimento e 2 mm de diâmetro interno); fase estacionária RP-18 endcapped; 5 µm de diâmetro de partícula. c) Preparação dos padrões/amostras As soluções dos padrões e das amostras devem ser preparadas com os solventes utilizados na fase móvel e devem conter o agente ionizante. As concentrações dos padrões para injecção directa no MS e desenvolvimento desta componente do método de análise devem ser da ordem de 10-6 M. Cada grupo de trabalho é responsável pela qualidade das amostras que entrega para análise e eventuais danos que amostras demasiado concentradas ou demasiado contaminadas com interferentes possam provocar no equipamento. As amostras devem ser purificadas o mais possível. A presença de contaminantes, além de poder contaminar a fonte a a ion optics, pode modificar os espectros de massas e elevar o limite de detecção em várias ordens de grandeza. A análise das amostras por HPLC com detecção a 220 nm e por GC com FID (Flame Ionization Detector) permitem avaliar a presença de contaminantes e a eficiência do processo de clean-up. 2 Informação necessária para implementar o método LC-MS No sentido de optimizar a utilização do LC-MS é necessário fornecer um documento, aquando da marcação, com a seguinte informação: Ficha de Utilização 1 a) Nome da pessoa responsável que solicita o serviço b) Nome da pessoa que acompanha o trabalho. c) Grupo e entidade institucional a que pertence (Centro, Faculdade, etc.) d) Tempo de utilização solicitado (previsão) 2 Objectivo do trabalho 3 Parâmetros físico-químicos e cromatográficos (preencher com o maior número de dados possível) a) Nome comum do composto(s) b) Solubilidade em água c) Peso e estrutura moleculares d) Espectro de massas por impacto electrónico (GC-MS)

3 e) Espectro de absorção no Ultravioleta-Visível f) Cromatograma LC com detecção a 220 nm g) Concentração e volume injectado h) Fluxo e composição do sistema eluente i) Coluna e temperatura durante a análise j) Espetro e condições de análise por ESI-MS Para muitos compostos, parte das informações solicitadas encontra-se em bases de dados disponíveis na Web como por exemplo a NIST (nomes, pesos e estruturas, espectros de UV, espectros de massas, ou o Merck Index (disponível na biblioteca geral da Universidade). Os estudos por injecção directa no MS necessitam das informações nas alíneas a) a d). Em anexo junta-se um exemplo das informações solicitadas para o herbicida Napropamida. 3 Análise dos padrões/amostras A análise estrutural a realizar neste tipo de equipamento é necessariamente feita por injecção directa, através de bomba de seringa, utilizando soluções padrão das substâncias a analisar ou amostras previamente isoladas e purificadas. O grau de pureza das soluções a caracterizar é determinante para a qualidade do resultado a obter. As amostras devem ser preparadas de acordo com a alínea c) do ponto 2 e deverão ser entregues no laboratório de cromatografia. Para injecção directa no MS 10 ml de solução deverão ser suficientes na maior parte dos casos; para o LC-MS as amostras/padrões deverão ser entregues em vials para autosampler. 4 Realização do trabalho Cada equipa de trabalho terá um responsável pela execução do mesmo e com formação adequada na área, nomeadamente ao nível do processo de aquisição de resultados e análise dos mesmos. Ver documento LC-MS method development guidelines para utilização do sistema Agilent 1200 Bruker Daltonic HCT ultra. 5 Marcações A utilização do equipamento deve ser solicitada por acompanhada da respectiva ficha de utilização do serviço. 6 Resultados Os resultados serão entregues em bruto, cabendo ao grupo a sua análise e interpretação.

4 ma Sinal Ficha de utilização do LC-MS 1 a) Nome da pessoa responsável que solicita o serviço: José Paulo Silva b) Nome da pessoa que acompanha o trabalho: José Paulo Silva b) Grupo e entidade institucional a que pertence: Meditbio c) Tempo de utilização solicitado (previsão): 1 semana 2 - Objectivo Estudo do padrão de fragmentação de um herbicida do grupo das amidas (ionização ESI, modo positivo) para avaliação da reacção e dos fragmentos a utilizar na sua quantificação por LC-MS. Curva de calibração. 3 - Parâmetros Físico-Químicos e Cromatográficos do(s) composto(s) A - Nome: Napropamida B - Solubilidade em água: 73 mg/l C - Peso e estrutura moleculares: 271, F - Cromatograma LC com detecção a 220 nm: D - Espectro de massas por impacto electrónico (GC-MS): E - Espectro de absorção no Ultravioleta- Visível: l/nm Tempo/min G - Concentração e volume injectado: M, 2 µl H - Fluxo e composição do sistema eluente: Tempo (min) Fluxo (ml/min) Água (%) Acetonitrilo (%) Metanol (%) I - Coluna e temperatura durante a análise: Purospher STAR (Merck) LiChroCART 125-2, RP-18, 5 µm, 30 ºC. J Parâmetros de ESI-MS: Potencial do capilar: 4000 V; Fluxo do gás de secagem: 7 L/min; Temperatura do gás de secagem: 300 ºC. Pressão de nebulização: 40 psi. Para métodos em MRM indicar as transições.

5 Descrição dos padrões/amostras A Padrão de napropamida. Solução aquosa, 10 ml, concentração M, 0.1% de ácido fórmico. Tipo de estudo: Injecção directa no MS. B Padrão de napropamida. Solução aquosa, 1.5 ml, concentração M, 0.1% de ácido C Padrão de napropamida. Solução aquosa, 1.5 ml, concentração M, 0.1% de ácido D Padrão de napropamida. Solução aquosa, 1.5 ml, concentração M, 0.1% de ácido E Padrão de napropamida. Solução aquosa, 1.5 ml, concentração M, 0.1% de ácido F Padrão de napropamida. Solução aquosa, 1.5 ml, concentração M, 0.1% de ácido G Amostra de napropamida. Solução aquosa irradiada, 1.5 ml, concentração desconhecida, 0.1% de ácido fórmico. Tipo de estudo: Análise por LC-MS.

6 Ficha de utilização do LC-MS 1 a) Nome da pessoa responsável que solicita o serviço: b) Nome da pessoa que acompanha o trabalho: b) Grupo e entidade institucional a que pertence: c) Tempo de utilização solicitado (previsão): 2 - Objectivo 3 - Parâmetros Físico-Químicos e Cromatográficos do(s) composto(s) A - Nome: B - Solubilidade em água: C - Peso e estrutura moleculares: D - Espectro de massas por impacto electrónico (GC-MS): E - Espectro de absorção no Ultravioleta-Visível: F - Cromatograma LC com detecção a 220 nm: G - Concentração e volume injectado: M, 2 µl H - Fluxo e composição do sistema eluente: I - Coluna e temperatura durante a análise: J Parâmetros de ESI-MS: Descrição dos padrões/amostras A Padrão. Tipo de estudo:

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