Resumo. Abstract. Palavras-chave: biodiesel, glicerina livre, glicerina total, automação, cromatografia gasosa.

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1 Preparação automática e on-line de padrões e amostras na determinação de glicerina livre e total em biodiesel em conformidade com os métodos ASTM D6584 e EN Resumo Autores: Danilo Pierone, Andrea Caruso, Massimo Santoro 1 2 Nova Analítica, São Paulo, SP, Br; Termo Fisher Scientific, Milan, Italy para contato: danilo.pierone@novanalitica.com.br A determinação de glicerina livre e total em biodiesel... segundo os métodos ASTM D6584 e EN requer... a execução de várias operações manuais na preparação... de soluções de calibração e a adição de agentes... derivatizantes na amostra antes da análise por... cromatografia gasosa. Essas etapas dos métodos... executadas manualmente são consideradas críticas... porque são demoradas e sujeitas a erros. Este trabalho... descreve a automação completa da preparação das... soluções de calibração e amostras e da determinação de glicerina livre e total... em biodiesel, através do emprego de um amostrador automático programado para executar as etapas de preparação em uma sequencia, antes da injeção no cromatógrafo a gás. São apresentados resultados que comprovam a alta precisão na preparação das soluções e a inexistência de contaminação cruzada. Uma redução dos volumes consumidos de padrões, solventes e do agente de derivatização é um benefício adicional deste sistema automático on-line. Palavras-chave: biodiesel, glicerina livre, glicerina total, automação, cromatografia gasosa. Abstract Following methods EN14105 and ASTM D6584 for the determination of free and total glycerin in biodiesel requires the chemist to perform several manual operations while preparing standards or when adding derivatizing agents in the sample prior to GC analysis. These manual sample preparation steps are usually considered critical, time consuming and prone to human errors. This work describes the full automation of the calibration solutions and samples preparation and analysis of free and total glycerin in biodiesel achieved through an autosampler programmed to perform the sample preparation steps in a sequence, before sample injection into the gas chromatograph. Data will be presented showing the high precision sample handling and no cross-contamination. A reduction of standards, solvents and derivatizing agent volumes is a further benefit of this on-line automated system. Keywords: biodiesel, free glycerin, total glycerin, automation, gas chromatography.

2 1. Introdução O biodiesel é composto por ésteres metílicos ou etílicos de ácidos graxos de óleos vegetais ou gordura animal. O processo mais usual de produção de biodiesel é a reação de transesterificação dos triglicerídeos, cujo produto pode conter as matérias-primas não reagidas (triglicerídeos e álcool), traços de glicerina, que é um subproduto separado do biodiesel durante o processo de fabricação, e traços de mono e diglicerídeos formados como intermediários da reação.... Para ser comercializado, o biodiesel deve atender às especificações definidas em normas oficiais que indicam as características do produto a serem controladas e seus respectivos valores aceitos. A qualidade do biodiesel B100 é avaliada, entre outras características, pelos seus conteúdos de glicerina livre e total, determinados segundo as 1,2 normas EN e ASTM D6584. Essas normas definem a análise da amostra por cromatografia em fase gasosa (GC), após derivatização com N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA) para converter os grupos OH em grupos OSi(Me). 3 A quantificação é feita pelo emprego de dois padrões internos: 1,2,4-butanotriol e tricaprina, para a determinação de glicerina e de mono, di e triglicerídeos, respectivamente. O conteúdo de glicerina combinada na amostra, para determinação da glicerina total, é calculado pela aplicação de fatores de conversão médios aos mono, di e triglicerídeos. Os métodos ASTM D6584 e EN implicam na preparação de várias soluções de padrões para a construção das curvas analíticas e na adição do agente de derivatização nas amostras antes da análise por GC. O tempo necessário para preparar manualmente um único conjunto de soluções de calibração varia em média entre 1h e 1:30h. A preparação de cada amostra envolve de três a sete pipetagens e o tempo de derivatização limita o número de amostras que podem ser preparadas em paralelo por um analista. Este procedimento feito manualmente é demorado e sujeito a erros.... Este trabalho descreve um procedimento de determinação de glicerina livre e total em biodiesel com o emprego de um amostrador automático para GC e GC-MS que executa todas as etapas de preparação das soluções de calibração e das amostras, além da injeção no cromatógrafo...

3 2. Materiais e métodos 2.1. Padrões e Reagentes Soluções preparadas previamente:... Soluções estoque de glicerina (500 µg/ml) e de mono, di e triglicérides (5000 µg/ml cada solução) em piridina. Estas soluções serão usadas pelo amostrador automático TriPlus RSH na preparação das soluções de calibração.... Soluções de butanotriol (1000 μg/ml) e de tricaprina (8000 μg/ml), adotados como padrões internos N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida (MSTFA), reagente derivatizante n-heptano grau HPLC, empregado para interromper a reação de derivatização Instrumentação Cromatógrafo a gás modular TRACE 1310 (Thermo Fisher Scientific) com injetor PTV (injetor com programação de temperatura) e detector FID (detector por ionização em chama) Amostrador automático TriPlus RSH (Thermo Fisher Scientific) que, através de uma sequência pré-compilada de operações (Prep Cycle Biodiesel), executa automaticamente a preparação das soluções de calibração e das amostras. O TriPlus RSH utiliza até seis seringas diferentes, que são trocadas automaticamente de acordo com os métodos programados, sem a intervenção de um analista. Um Vortexer embutido no TriPlus RSH agita vigorosamente os vials para a homogeneização das soluções de padrões e amostras Coluna capilar metálica TraceGOLD TG-5MT (Thermo Fisher Scientific) (15 m x 0,25 mm x 0,1 μm), com temperatura máxima de aquecimento igual a 430 C e pré-coluna capilar de sílica desativada e sem fase estacionária (2 m x 0,53 mm). Tabela 1 - Condições cromatográficas adotadas na determinação de glicerina livre e total em biodiesel.

4 2.3. Preparação da Instrumentação Itens necessários na configuração do TriPlus RSH:... Estação de troca automática de seringas, com três seringas: 100 µl para os reagentes, 10 ml para n-heptano e 10 µl para as injeções no cromatógrafo. Estação de solventes com três frascos contendo n-heptano. Estação de lavagem com um frasco de solvente e outro para descarte.vortexer para homogeneização Preparação do TriPlus RSH para as análises:... Colocar na bandeja os vials de 10 ml vazios para as soluções de calibração e os vials com 100 mg de amostras de biodiesel. A pesagem da amostra é a única etapa manual deste procedimento analítico. Colocar as soluções de padrões e os solventes de lavagem na bandeja de 15 vials de 10 ml, conforme Figura 1-(A) para ASTM D6584 e 1-(B) para EN (A) (B) Figura 1 Distribuição dos vials de padrões e de solvente de lavagem na bandeja para 15 vials. (A) para execução do método ASTM 6584; (B) para EN14105.

5 2.4. Etapas realizadas pelo TriPlus RSH segundo o método ASTM D Preparação de cinco soluções de calibração:... O TriPlus RSH transfere os volumes especificados na Tabela 2 diretamente para os vials vazios de 10 ml. Adiciona 100 μl do agente derivatizante MSTFA e agita para homogeneização. Após um período de min, o TriPlus RSH adiciona 8 ml de n-heptano em cada vial e agita Preparação das amostras:... O TriPlus RSH adiciona 100 μl de cada um dos dois padrões internos e 100 μl de MSTFA em cada vial com amostra e agita para homogeneização. Após um período de min, o TriPlus RSH adiciona 8 ml de n-heptano em cada vial e agita. A execução de cada etapa leva em conta o tempo de derivatização necessário tanto para as amostras quanto para os padrões.... Tabela 2 Volumes (µl) das soluções estoque de padrões adicionados pelo TriPlus RSH em vials de 10 ml para a preparação de cinco soluções de calibração conforme o método ASTM D Etapas realizadas pelo TriPlus RSH segundo o método EN 14105: Preparação de quatro soluções de calibração:... O TriPlus RSH transfere os volumes especificados na Tabela 3 diretamente para os vials vazios de 10 ml previamente fechados. Adiciona 150 μl do agente derivatizante MSTFA e agita para homogeneização. Após um período de min, o TriPlus RSH adiciona 8 ml de n-heptano em cada vial e agita.... Tabela 3 Volumes (µl) adicionados pelo TriPlus RSH em vials de 10 ml para a preparação de quatro soluções de calibração conforme o método EN

6 Preparação das amostras:... O TriPlus RSH adiciona 80 μl de butanotriol (padrão interno), 200 μl da mistura de padrões de mono, di e triglicerideos, 200 μl de piridina e 200 μl de MSTFA nos vials das amostras e agita para homogeneização. Após um período de min, o TriPlus RSH adiciona 8 ml de n-heptano em cada vial e agita. A execução de cada etapa leva em conta o tempo de derivatização necessário tanto para as amostras quanto para os padrões. 3. Resultados Método ASTM D Dois exemplos de cromatogramas obtidos através do método ASTM D6584 estão apresentados na Figura 2, na qual (a) corresponde a uma amostra de biodiesel e (b) a uma solução de calibração. Figura 2 Cromatogramas obtidos através do método ASTM D6584: (a) amostra de biodiesel; (b) solução de calibração. Na Tabela 4 estão apresentados os resultados de glicerina livre, combinada e total obtidos na análise de doze amostras de biodiesel e expressos como porcentagem em massa.

7 Tabela 4 Resultados de glicerina livre, combinada e total em amostras de biodiesel, expressos como % em massa e obtidos através do método ASTM D6584. O método ASTM D6584 estabelece alguns critérios de aceitabilidade dos resultados e um deles é a linearidade. As curvas analíticas preparadas pelo TriPlus RSH para glicerina, mono, di e triglicerídeos apresentam coeficientes de correlação > ou = 0,99 (Figura 3) conforme necessário para atender a esse método. Figura 3 - Curvas analíticas preparadas pelo TriPlus RSH pelo método ASTM D6584.

8 Outros critérios de aceitação dos resultados são repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R).... Para a repetibilidade o método afirma que: A diferença entre corridas sucessivas obtidas pelo mesmo operador com a mesma aparelhagem, sob condições de operação constantes sobre uma amostra idêntica poderá exceder o valor calculado de r uma vez em vinte.... Para a reprodutibilidade o método afirma que: A diferença entre os resultados de duas corridas independentes, obtidas por operadores diferentes, trabalhando em laboratórios diferentes, nas condições de operação do método, sobre uma amostra idêntica poderá exceder o valor calculado de R uma vez em vinte.... A repetibilidade dos resultados de glicerina livre e total obtidos pelo método ASTM D6584 está apresentada na Figura 4. Todas as amostras testadas atenderam ao critério de precisão do método.... Figura 4 Valores de repetibilidade (r) e da diferença entre os resultados de duas corridas independentes () para glicerina livre e total, pelo método ASTM D Resultados obtidos para o método EN O cromatograma de uma amostra de biodiesel obtido pelo método EN está apresentado na Figura 2. As regiões destacadas neste cromatograma indicam as janelas de eluição da glicerina, mono, di e triglicerídeos. Os picos mais intensos nessas regiões são dos padrões internos.

9 Figura 5 Cromatograma de uma amostra de biodiesel obtido pelo método EN Na Tabela 5 estão apresentados os resultados de glicerina livre e total obtidos na análise de treze amostras de biodiesel e expressos como porcentagem em massa. Tabela 5 - Resultados de glicerina livre e total em amostras de biodiesel expressos como % em massa e obtidos através do método EN

10 A Figura 6 apresenta uma curva analítica para glicerina preparada pelo TriPlus RSH segundo o método EN 14105, a qual demonstra a grande linearidade alcançada. Figura 6 Curva analítica preparada pelo TriPlus RSH para a glicerina, pelo método EN A repetibilidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos na determinação de glicerina livre e total em vinte amostras de biodiesel atenderam aos critérios de precisão do método EN (Figuras 7 e 8). Figura 7 Valores de repetibilidade (r) e da diferença entre os resultados de duas corridas independentes para glicerina livre e total, pelo método EN

11 Figura 8 Valores de reprodutibilidade (R) e da diferença entre os resultados de duas corridas independentes para glicerina livre e total, pelo método EN Conclusão... Os resultados obtidos neste trabalho comprovam que o emprego do amostrador robotizado TriPlus RSH é eficiente na automação dos procedimentos analíticos de determinação de glicerina livre e total em biodiesel segundo os métodos ASTM D6584 e EN O TriPlus RSH garante alta precisão na manipulação das soluções e amostras, sem ocorrência de contaminação cruzada. Uma redução dos volumes utilizados de padrões, solventes e do agente derivatizante, e uma economia de tempo e espaço do laboratório foram vantagens adicionais observadas com o emprego do amostrador automático TriPlus RSH Referências... (1) EN 14105: Fat and oil derivatives Fatty Acid Methyl Esters (FAME) - Determination of free and total glycerol and mono-, di-, tri-glyceride content. (2) ASTM D6584: Standard Test Method for Determination of Free and Total Glycerin in B-100 Biodiesel Methyl Esters by Gas Chromatography.