MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE DIURON POR LC/MS UTILIZANDO A EXTRAÇÃO POR SPE

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1 09 a 11 de dezembro de 2015 Auditório da Universidade UNIT Aracaju - SE INSTRUÇÕES PARA A ELABORAÇÃO DE TRABALHOS COMPLETOS MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DE DIURON POR LC/MS UTILIZANDO A EXTRAÇÃO POR SPE Geise Silva Batista Cruz 1, Consuelo Dantas dos Santos 2 1 Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Aracaju, Brasil, geise_silva@itp.org.br 2 Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Aracaju, Brasil, consuelo_dantas@itp.org.br Resumo Com o aumento da produção agrícola e o uso de herbicidas e pesticidas, surgiu a preocupação em relação à contaminação do solo e de mananciais com estes compostos, já que eles podem permanecer por tempo suficiente para causar danos aos ecossistemas. A partir daí tem se intensificado os estudos e monitoramentos periódicos para avaliar possíveis danos. Diante disso este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia analítica aplicando a extração em fase sólida para análise do herbicida Diuron em água utilizando um método no LC/MS para detecção e quantificação deste composto. Ao analisar o padrão do Diuron por LC/MS as concentrações obtidas para preparar a curva de calibração abrangeram a faixa entre 10 a 500 µg/l, obtive-se um correlação de 0,99972, limite de detecção de 5 µg/l e limite de quantificação de 10 µg/l. Por essa metodologia, um volume de 250 ml de amostra de água é passando por uma etapa de pré-concentração, utilizando cartucho para fase reversa, C18, e fazendo uso do sistema SPE, que é uma das técnicas de extração mais utilizada em fase sólida. Por esta técnica, os analitos da matriz aquosa são extraídos juntos com seus interferentes ao passarem pelo cartucho contendo sorvente. É usado um solvente de lavagem, a água, e outro solvente orgânico para extrair os analitos de interesse. A validação do método foi realizada também, através de ensaios de recuperação do diuron em amostras de água ultrapura após a extração em fase sólida. Os testes de recuperação foram feitos utilizando 1, 2 e 3 ml de acetonitrila como solvente extrator, sendo que com 3 ml a recuperação ficou em torno de 95%, com 2mL recuperou 87,26% e com 1mL a recuperação foi baixa, em torno de 50%. O método mostrou-se eficiente, sendo sua comprovação avaliada através da aprovação no Canadian Association for Laboratory Accreditation (CALA) pelo Proficiency Testing. Palavras-chave: Diuron, SPE, LC/MS 1

2 1. INTRODUÇÃO O N- (3, 4-diclorofenil) -N, N-dimetilureia (C9H10Cl2N2O) é o nome químico do Diuron utilizado pela IUPAC. É um composto de aspecto branco, cristalino e quase inodoro, não-volátil e não-iônico, solúvel em água e o tempo de meia vida no solo é de 328 ± 212 dias [1]. Em temperatura ambiente é estável e pode se decompor em temperaturas a partir de 180 a 190ºC. O diuron é um herbicida utilizado para controlar o crescimento de ervas daninhas, o período de aplicação deve possuir cuidados para não interferir no rendimento das sementes, pois ele permite que essas ervas semeiem normalmente, entretanto faz com que elas percam sua coloração verde fazendo com que a planta morra [2]. Normalmente é usado em plantações por ter grande eficiência e um menos custo de uso, o modo de aplicação pode ser préemergente e pós-emergente. No Brasil é empregado em plantações de cana de açúcar de modo pré obtendo resultado de alta eficiência. Pode ser usado também em plantações de milho, feijão, algodão, café e frutas. Estudos indicam que o Diuron possui baixo teor de adsorção no solo e em sedimentos, podendo ser extinto por meses do solo, já em relação à água o diuron tem a facilidade de migrar para águas subterrâneas através do escoamento superficial das águas das chuvas [2;3]. Segundo a portaria do Ministério da Saúde nº 2914/2011, o valor máximo permitido do diuron em águas é de 90 µg/l [4], pois de acordo com a Ordem Mundial de Saúde, cada país deve possuir seus limites para cada pesticida. Devido a isto é necessário realizar monitoramentos para acompanhar os valores que são liberados diariamente. Para que sejam verificados esses valores, várias técnicas instrumentais são utilizadas para determinação destes compostos. Neste trabalho foi utilizada a técnica da Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas (LC/EM), este por sua vez pode ser utilizado em misturas complexas em diversas áreas da ciência, tais como, sedimentos de rios, produtos naturais dentre outros. O modelo usado foi o LC/MS 1260 da Agilent Technologies com Quadrupolo, através do impacto de elétrons ou ionização por elétrons, que é gerada através do eletrospray. Neste método a amostra é dissolvida no eluente e em seguida é pressurizada através de um tudo de aço inox em forma de aerossol, esses íons são enviados para o MS, onde são induzidos pela atração eletrostática e pelo vácuo gerado [5]. Os resultados são analisados com o auxílio de softwares que determinam a localização dos picos, identificando por comparação dos tempos de retenção e das m/z encontradas na amostra. Para provar que um método está sendo adequado, é necessário fazer a validação do método, pois ela pode provar que o método fornece resultados esperados com credibilidade, precisão e exatidão adequadas. Não há uma ideia comum dos quais parâmetros devem ser validados, eles variam de uma área para outra. Por exemplo, no Brasil existe vários aspectos que diferem entre a área de saúde e agricultura. O Inmetro possui sistema próprio e independente para validação de ensaios analíticos [6]. Neste estudo a preparação das amostras foi realizada utilizando o sistema de extração em fase sólida (SPE). A identificação e quantificação do diuron foi realizada por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas. A validação do método foi feita analisando os seguintes parâmetros: limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e precisão. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Desenvolver método analítico para determinação do diuron em água Objetivos específicos Obter as condições cromatográficas para análise do diuron na água; Obter parâmetros de validação de método utilizando a extração em fase sólida (SPE); 3. MÉTODOS E MATERIAS 2

3 3.1 MÉTODO DE PREPARO E ANÁLISE Extração em fase sólida (SPE) Cartuchos descartáveis C18, de 6mL com 500mg de fase foram utilizados no procedimento de extração por SPE. O procedimento da extração em fase sólida foi realizado da seguinte maneira: 3mL de Acetonitrila foi utilizado para o condicionamento da fase; 3 ml de água ultrapura. Em seguida 250 ml da amostra de água ultrapura previamente contaminada com uma concentração conhecida de padrão do diuron foi passada pelo cartucho. Em seguida, na fase de limpeza e remoção de interferentes, 3mL de água é adicionado ao cartucho até a completa secagem. A eluição do diuron adsorvido na fase é feita utilizando 2mL de acetonitrila. O extrato obtido é transferido para um vial e guardado em refrigerador à 4 ºC até a analise por LC/MS. O branco do método é obtido da mesma forma que a amostra, neste caso utiliza-se somente água ultrapura ou deionizada. Figura 1: Etapas envolvidas no SPE Os experimentos foram realizados com o auxilio de um sistema de extração acoplado a uma bomba de vácuo (Figura 2). Figura 2: Sistema de extração em fase sólida 3

4 Condições cromatográficas As condições cromatográficas otimizadas para determinação do Diuron estão descritas na tabela 1. Instrumento Coluna Condições Cromatográficas LC/MS 6120 Agilent Tecnologies Pescosphpre Crtridge CRC 18 33x4,6 mm Temperatura do forno 50ºC Fase Móvel Fluxo ACN/Agua(com formiato de amônio, e ácido fosfórico 0,5 ml/min Volume de injeção 10µL Tempo de análise Tempo de estabilização Fluxo do gás Pressão do Nebulizador 12 min 5 min Condições do espectro de massas 3L/min 20 Psi Temperatura do gás 300ºC Voltagem do capilar Positivo(3500); Negativo(3500) Tabela 1. Especificações do método cromatográfico empregado na análise do diuron Materiais e equipamentos utilizados Cromatógrafo líquido, Agilent Tecnologies modelo LC/MS 6120, acoplado a detector de massas tipo quadrupolo, massa range de m/z. Um sistema analítico completo com injeção automática de amostra, inclui todos acessórios necessários, incluindo seringa de injeção, coluna analítica, vidraria adequada para fase móvel e degaseificador acoplado ao sistema; Coluna Pescosphpre Crtridge CRC 18 33x4,6 mm (Perkin Elmer) Micropipetas automáticas calibradas; Cartucho Strata C18-U (55um,70A), Dimensão: 1000mg/6mL; Vidraria comum de laboratório; Sistema para SPE vacum manifolds (phenomenex); Filtro de Nitrato de celulose 0,45µm; 3.3 Soluções, padrões e reagentes Acetonitrila grau Pesticida ou HPLC; Padrão ISO Accredited, 98% pureza e incerteza expandida de 0,0057 4

5 Soluções padrão estoque, que devem ser preparadas a partir de padrões puros ou soluções certificadas dos compostos a serem quantificados; Agua reagente livre de compostos orgânicos (ultrapura); Ácido Fórmico, grau reagente 95%; Formiato de amônio 0,315g/mL(5M) em água deionizada; 4. RESULTADOS 4.1 Validação do procedimento analítico No intuito de garantir que um método de análise seja confiável, é necessário que seja feita uma validação do método. Essa validação começa no planejamento estratégico e continua ao longo de todo o procedimento analítico sendo necessário a criação de documentos, chamados diretrizes, que são exigidas pelos orgãos regulamentadores do Brasil e outros países para registros de novos produtos e métodos [7]. Os parâmetros analíticos mais utilizados na validação de métodos, encontrados na literatura são: curva analítica; linearidade, seletividade; recuperação; limite de detecção e limite de quantificação [8]. A curva analítica foi preparada através de uma solução estoque de 100µL do padrão certificado do Diuron. Alíquotas dessa solução foram retiradas de modo a obter as soluções de trabalho nas concentrações de 5; 10; 25; 100 e 200 µl. Para estudo de recuperação, um volume de 250 ml de uma amostra de água na concentração de 30 µl foi testado utilizando 1, 2 e 3 ml de acetonitrila como solvente extrator, sendo que com 3 ml a recuperação ficou em torno de 95%, com 2mL recuperou 87,26% e com 1mL a recuperação foi baixa, em torno de 50%. Diante disso, 10 µl dos extrato, foram injetados no LC/MS obtendo suas respectivas áreas e concentrações. Com os dados obtidos na construção da curva analítica, podemos dizer que o modelo de regressão linear é adequado para o estudo desse método analítico. A curva analítica feita com cinco pontos, apresentou um coeficiente de correlação(r) maior que 0,99, estando coerente com as recomendações do Inmetro e Anvisa, que especificam um r maior que 0,90 e 0,99 respectivamente. Figura 3: Curva analítica do diuron Para determinação dos parâmetros analíticos, foram escolhidos três pontos da curva analítica: 10, 25 e 100 µl. Foram preparados dez padrões para cada concentração e em seguidas analisados no LC/MS. Na tabela 2, mostra os valores encontrados e os parâmetros escolhidos para validar o método. 5

6 PARAMETROS Padrão 10 (µ/l) Padrão 25 (µ/l) Padrão 100 (µ/l) MEDIA 12,076 22,98 72,26 DESVIO PADRÃO 1, , , CV 11,4 7,88 9,45 VALOR VERDADEIRO %RECUPERAÇÃO 120,76 91,92 72,26 LQ (µ/l) LD (µ/l) Tabela 2. Dados da validação O estudo da recuperação foi realizado pelo uso da padronização externa, e através dela foi determinada a exatidão do método. Os valores de recuperação obtido para o analito estudado, está compreendido entre 70 e 130%, o que demonstra está de acordo com a literatura sobre validação de métodos cromatográficos de resíduos. A avaliação da precisão foi feita através da determinação do Coeficiente de Variação (CV), que é uma medida de variabilidade do método e representa o desvio padrão expresso como porcentagem da média. Segundo Pimentel Gomes (2000), se o coeficiente de variação for inferior a 10% considera-se o mesmo como baixo, tendo o experimento uma alta precisão, de 10% a 20% os CVs são considerados com boa precisão, acima são julgados altos, significando baixa precisão e acima de 30% a precisão é muito baixa. O limite de Detecção (LD) e o limite de Quantificação (LQ), representam a menor que concentração que pode ser detectada e quantificada respectivamente [9]. A determinação desses limites são essenciais para determinação qualitativa e quantitativa de traços de substancias químicas presentes na amostra. Para a validação dos níveis dos limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) de qualquer pesticida, os compostos de interesse na amostra fortifica devem ser analisado próximo ao nível de concentração desejado, onde será possível detectar e/ou quantificar os analitos [10]. O LD e o LQ foram determinados através de diluições sucessivas. A metodologia empregada, demostrou que o método foi capaz de conseguir valores de concentração de LD e LQ abaixo do valor máximo permitido pela legislação. As figuras 4 e 5 mostram uma sobreposição dos picos cromatográficos do diuron com seu tempo de retenção e espectro. O tempo de retenção é de 7,514 com uma pequena variação de uma concentração para outra, e a m/z do diuron é 233. Figura 4: Sobreposição de picos 6

7 Figura 5: Espectro de Massa do Diuron (M+H) Para garantir a qualidade de um método realizado em um laboratório, existe uma ferramenta muito importante que é a participação em testes de proficiência, que permite aos laboratórios monitorar seu desempenho e comparar seus resultados com outros laboratórios similares. O programa de Teste de Proficiência CALA, consiste geralmente na analise de quatro amostras com concentrações desconhecidas para o laboratório que analisa as amostras e reportam seus resultados. Em uma avaliação dessa, esse método foi proficiente de acordo com os parâmetros de avaliação do CALA, conforme mostra a tabela 3. AMOSTRA ANALITO METODO VALOR ATRIBUÍDO VALOR REPORTADO Z SCORE SITUAÇÃO C22-1 DIURON LC/MS 17,4 20,3 0,614 ACEITÁVEL C22-2 DIURON LC/MS 25,4 31,4 0,904 ACEITÁVEL C22-3 DIURON LC/MS 35 49,6 1,64 ACEITÁVEL C22-4 DIURON LC/MS 16,4 24,1 1,715 ACEITÁVEL Tabela 3. Dados do resultado de Teste de proficiência 5. CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos no processo de validação e com a aprovação no teste de proficiência, é possível dizer que o método relatado é satisfatório. 7

8 6. REFERENCIAS [1] C. B. RITA,; D. S. MANOEL. Sorção de Diuron em Solos com Diferentes Texturas. Circular Técnica 9. Embrapa. Jaguariúna, SP, [2] M. ADRIANA. Environmental Fate of Diuron. Environmental Monitoring Branch. Department of Pesticide Regulation. [3] M. G. FLÁVIO. Controle das Plantas Daninhas na Cultura da Cana-De-Açúcar. Blanco Instituto Biológico, Centro Experimental Central do Instituto Biológico, Campinas, SP, Brasil. Disponível em:< Acesso em 08 de outubro de [4] MINISTÉRIO DA SAÚDE. Portaria nº 2.914, de 12 de dezembro de Disponível em: < Acesso em 08 de outubro de [5] M. L. FERNANDO. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente compatíveis?. Cromatografia líquida (LC) / Espectrometria de Massas. Scientia Chromatographica, vol. 1, nº2, São Paulo, [6] Lanças, Fernando M. Validação de métodos cromatográficos de análise/fernando M. Lanças São Carlos: RiMa, p. [7] R. Marcelo et al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, Jun 2004, vol.27, no.5, p [8] N M. BRITO; O P A JUNIOR,.; POLESE, L.; RIBEIRO, M. Validação de métodos analíticos: estratégia e discussão. Pesticidas: Revista Ecotoxicologia e MeiBo Ambiente, Curitiba, jan./dez. v. 13, p , [9] Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO); Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos, DOQ-CGCRE-008, 2003 [10] EUROPEAN COMMISSION. Directorate General Health and Consumer Protection. Guidance document on residue analytical methods. North Yorkshire, 2000a. 16 p. (Documento SANCO /825/00, rev. 6). 8