Seleção de um Método Analítico. Validação e protocolos em análises químicas. Validação de Métodos Analíticos

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1 Seleção de um Método Analítico Capítulo 1 SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5 a edição, Ed. Bookman, Porto Alegre, Validação e protocolos em análises químicas CONSELHO REGIONAL DE QUÍMICA - IV REGIÃO (SP) MINICURSO 2010 Validação de Métodos Analíticos Validação de Métodos Analíticos ADRIANE_NUNES.pdf Dra. Adriane Medeiros Nunes Laboratório de Metrologia Química Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel Características de eficiência dos instrumentos Capítulo 1 SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5 a edição, Ed. Bookman, Porto Alegre, Dra. Adriane Medeiros Nunes Laboratório de Metrologia Química Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel 1

2 ANVISA VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS No caso de metodologia analítica não descrita em farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será considerada validada, desde que sejam avaliados os parâmetros relacionados a seguir : Especificidade e Seletividade Linearidade Intervalo Precisão Limite de detecção (sensibilidade) Limite de quantificação Exatidão Robustez Seletividade A seletividade de um método analítico refere-se ao grau em que o método está livre de interferência de outras espécies contidas na matriz da amostra. Infelizmente, nenhum método analítico está totalmente livre de interferência de outras espécies e, freqüentemente, alguma ação tem que ser desenvolvida no sentido de minimizar os seus efeitos. SELETIVIDADE Capacidade de avaliar, de forma inequívoca, a substância de interesse na presença de componentes que possam interferir na análise. Comparar matriz isenta da substância de interesse e matriz + padrão. Uso de detectores que comparam o pico obtido na separação com o de um padrão (arranjo de diodos, espectrômetro de massas). Método da adição de um padrão. Coleta do composto de interesse e posterior análise com métodos ou técnicas específicas. 2

3 PRECISÃO E PRECISÃO A precisão de um método analítico está relacionada com a dispersão das medidas ao redor do seu valor médio. desvio padrão absoluto (s), n>20 n geralmente é pequeno, e o que se calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto (s). Lanças, Fernando M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise São Carlos : RiMa, 2004 PRECISÃO A precisão em validação de métodos é considerada em três níveis diferentes: Repetibilidade Precisão intermediária Reprodutibilidade PRECISÃO Repetibilidade (precisão intra-corrida) concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de medição (analista, instrumento e condições, local, curto intervalo de tempo) ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) Mínimo de 9 determinações (ex: 3 níveis de concentração, 3 réplicas) ou 6 determinações de 1 concentração INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia) 7 ou + repetições PRECISÃO Precisão intermediária (precisão inter-corridas) indica o efeito das variações dentro do laboratório devido a eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores. Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial) grau de concordância entre os resultados das medições de uma mesma amostra, efetuada sob condições variadas (mudança de operador, local, equipamentos, etc.) INMETRO - No mínimo 5 laboratórios 3

4 Repetibilidade A repetibilidade expressa a fidelidade obtida nas mesmas condições operacionais aplicadas em um curto intervalo de tempo. mesma amostra; mesmo analista; mesmo equipamento; mesmo momento; mesmo ajuste; mesma calibração. Reprodutibilidade A reprodutibilidade designa a fidelidade entre laboratórios, geralmente obtida em análise colaborativa. amostras diferentes do mesmo ponto amostral; diferentes analistas; diferentes equipamentos; diferentes momentos; diferentes técnicas; diferentes calibrações; diferentes ajustes. Grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro. A exatidão de um método analítico é definida como a diferença entre o valor obtido (média) e o valor verdadeiro presente na amostra. V médio V verdadeiro ANVISA Mínimo de 9 determinações (ex: 3 níveis, 3 réplicas) Como avaliar exatidão: materiais de referência comparação de métodos ensaios de recuperação MATERIAIS DE REFERÊNCIA CERTIFICADOS (CRM) Os valores obtidos pelo laboratório (a média e a estimativa do desvio padrão de uma série de replicatas) da mesma amostra padrão devem ser comparados com os valores certificados do material de referência, para verificar a exatidão do método. Parâmetros analíticos para validação de métodos Erro relativo (ER, %), exatidão (% bias) COMPARAÇÃO DE MÉTODOS Consiste na comparação entre resultados obtidos empregando-se o método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através de um método de referência, avaliando o grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão do método testado em relação ao de referência. Esta abordagem assume que a incerteza do método de referência é conhecida. 4

5 ENSAIOS DE RECUPERAÇÃO A recuperação (ou fator de recuperação), R, é definida como a proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na porção analítica do material teste, que é extraída e passível de ser quantificada. Padrões da substância adicionada à matriz isenta da substância ou à amostra (fortificação, incorporação, dopagem, enriquecimento, termos provenientes do inglês spiking ). Limitação a substância adicionada não está na mesma forma que a presente na amostra. Efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados. Dra. Adriane Medeiros Nunes Laboratório de Metrologia Química Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel Sensibilidade Sensibilidade de um instrumento ou de um método é uma medida de sua habilidade em discriminar entre pequenas diferenças na concentração de um analito. Dois fatores limitam a sensibilidade: a inclinação da curva de calibração e a reprodutibilidade ou precisão do dispositivo de medida. y = b x + a S = mc + S br onde S é o sinal medido, c é a concentração do analito, S br é o sinal do instrumento para o branco e m é a inclinação da reta. Dra. Adriane Medeiros Nunes Laboratório de Metrologia Química Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel A definição quantitativa de sensibilidade que é aceita pela IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemists - União Internacional de Química Pura e Aplicada) é a sensibilidade de calibração, que é a inclinação da curva de calibração. Sensibilidade de calibração Limite de Detecção Limite de detecção é a concentração, ou a massa mínima de um analito que pode ser detectado, porém, não necessariamente quantificado como um valor exato. Este limite depende da razão entre a magnitude do sinal analítico e o tamanho das flutuações estatísticas no sinal do branco. Limite de Detecção LD = 3R onde R = ruído Sensibilidade analítica, γ m γ = ss Onde, m representa a inclinação da curva de calibração e s s é o desvio-padrão da medida. α sensibilidade de calibração O sinal analítico mínimo distinguível ( Sm ) é então tomado como a soma do sinal médio do branco ( Sbr ) mais um múltiplo de k do desvio padrão do branco ( sbr ). k = 3 Sm = Sbr + ksbr Sm, pode ser determinado por medidas do branco repetidas 20 a 30 vezes, preferivelmente por um período extenso de tempo. Os dados resultantes são então tratados estatisticamente para obter Sbr, e sbr. O limite de detecção é dado por Sm = Sbr + ksbr Sbr R LD Sm 3R A sensibilidade analítica é dependente da concentração, uma vez s s pode variar com a concentração. Sm Sbr cm = m Obs. Curva de Calibração Sm = mc + Sbr, 5

6 LIMITE DE DETECÇÃO Método baseado em parâmetros da curva analítica 3,0 coeficiente linear (b) coeficiente angular (m) s = estimativa do desvio padrão do coeficiente linear da equação S = coeficiente angular da curva analítica (slope) y = mx + b Apêndice 1 Avaliação dos Dados Analíticos 1001 Apêndice 1 Avaliação dos Dados Analíticos 1001 PRINCÍPIOS DE ANÁLISE INSTRUMENTAL F. JAMES HOLLER, DOUGLAS A. SKOOG & STANLEY R.CROUCH Editora: BOOKMAN ISBN: ISBN13: Edição: 6ª Edição Número de Páginas: 1056 Apêndice 1 Avaliação dos Dados Analíticos estimativa do desvio padrão do coeficiente linear Lanças, Fernando M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise São Carlos : RiMA,

7 Limite de Quantificação Limite de Quantificação corresponde à menor quantidade de um analito que pode ser quantificada com exatidão e com uma fidelidade determinada. O limite inferior da medida quantitativa é considerado como sendo igual a dez vezes o desvio padrão das medidas repetitivas do branco, 10 s br. O sinal analítico mínimo de quantificação ( S m ) é então tomado como a soma do sinal médio do branco ( S br ) mais um múltiplo de k do desvio padrão do branco ( s br ). k = 10 S m = S br + ks Br EXEMPLO 1-1 Capitulo 1 (Skoog) A análise por regressão linear pelo método dos mínimos quadrados dos dados da curva de calibração para a determinação de Pb baseados nos espectros de emissão de chama resultou na seguinte equação. S = -0, ,162CPb Os seguintes dados de replicatas foram obtidos Pb (mg/l) No. Amostras Valores médios Desvio Padrão s 10, ,62 0,15 1, ,12 0,025 0, ,0296 0,0082 Calcule: a) Sensibilidade de calibração. b) Sensibilidade analítica em 1,0 e 10,0 ppm. c) Limite de detecção. Ex1. Pb (mg/l) S 0 0, , , y = 1,16206x - 0,00434 R² = 0, [Pb 2+ ] (mg/l) Linearidade Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de no mínimo 5 concentrações diferentes. Os resultados dos testes deverão ser tratados por métodos estatísticos apropriados para determinação do coeficiente de correlação, intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Se não houver relação linear, realizar transformação matemática. O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser = 0,99. ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária RE nº 899/ Anvisa 7

8 Lanças, Fernando M. Validação de Métodos Cromatográficos de Análise São Carlos : RiMA, 2004 ROBUSTEZ Mede a sensibilidade que o método apresenta face a pequenas variações. As mudanças introduzidas refletem as alterações que podem ocorrer quando um método é transportado para outros laboratórios, analistas ou equipamentos. Método cromatográfico: proporção solvente orgânico, ph e força iônica, temperatura. Questões e Problemas ( Capítulo 1 - Skoog ) 1-9 Os seguintes dados de calibração foram obtidos por um método instrumental para a determinação de espécies X em solução aquosa. Conc X, Cx ppm Número de Repetições, N Analítico Médio, S Desvio-padrão, 0, ,031 0,0079 2,00 5 0,173 0,0094 6,00 5 0,422 0, ,00 5 0,702 0, ,00 5 0,956 0, , ,0110 (a) Calcule a sensibilidade de calibração. (b) Calcule a sensibilidade analítica de cada concentração. (c) Calcule o coeficiente de variação para a média de cada conjunto de repetições. (d) Qual é o limite de detecção para o método. (e) Qual é o limite de quantificação para o método. Conc X, Cx Analítico mg/l Médio 0 0, , , , , ,248 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,06704x + 0,03001 R² = 0, [X] (mg/l) 8

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