PREPARO DE AMOSTRAS PARA ESPECTROMETRIA DE MASSAS
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- Vanessa Vilaverde Alencastre
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1 PREPARO DE AMOSTRAS PARA ESPECTROMETRIA DE MASSAS RECOMENDAÇÕES GERAIS - Tenha cuidado para que o recipiente seja adequado à natureza de sua amostra, para evitar vazamentos ou perda da amostra durante o transporte e/ou durante a abertura do recipiente. Evite preencher todo o volume do recipiente (deixe pelo menos 20% de espaço vazio entre a tampa e o volume de amostra colocado). - Envie a quantidade de amostra adequada à técnica (vide abaixo). - Ao identificar sua amostra, tenha o cuidado de colocar na etiqueta todas as informações necessárias (modelo de etiqueta em nosso site e certifique-se de que esta etiqueta seja de boa qualidade e não se desprenda do recipiente da amostra. Amostras que oferecem risco à saúde devem vir com a indicação TÓXICA escrita na etiqueta. - Qualquer dúvida não contemplada por estas diretrizes, favor consultar os analistas por (ms_ca@iq.usp.br). -A Central Analítica emite um relatório de análise, e a interpretação dos resultados é de responsabilidade do usuário. Não fazemos desenvolvimento e validação de métodos. Não emitimos laudo e não fazemos interpretação de resultados de LC-MS. Infusão direta pequenas moléculas (ESI ou APCI) - preferencialmente secas (cerca de 10 mg são suficientes) - Solubilidade: informar corretamente após realizar o teste de solubilidade - Informar condições que podem hidrolisar ou degradar a amostra, como presença de água, meio ácido e básico, etc. - Não conter tampão, sais e detergentes na amostra. - Verificar compatibilidade da estrutura molecular com o tipo de ionização. Por exemplo, hidrocarbonetos não são ionizáveis por ESI ou APCI; neste caso solicitar análise GC-MS (ionização por IE).
2 - Amostra pode ser enviada seca ou solubilizada. HPLC-MS pequenas moléculas puras ou misturas complexas - Solubilidade: informar corretamente após realizar o teste de solubilidade (solventes utilizados em HPLC-MS: Acetonitrila, Metanol e Água) - Para amostra solubilizada informar o solvente utilizado e a concentração em mg/ml. Tipicamente utilizamos a concentração de 1 mg/ml para as injeções. - Utilizar solvente grau HPLC ou grau HPLC-MS para o preparo das amostras (não utilizar solventes P.A. devido à presença de impurezas detectáveis no espectrômetro de massas) -Não utilizar soluções salinas ou tampões para solubilizar a amostra. -Não desenvolver metodologias utilizando tampões não voláteis como fase móvel (tampões e concentrações compatíveis com HLPC-MS ver Tabela 1) 1,2. - No caso da utilização de tampões/ácidos/bases voláteis, utilizar reagentes com alto grau de pureza, de preferência compatíveis com MS. -Evitar desenvolver metodologias utilizando TFA na fase móvel (pois a presença de TFA, em geral, suprime a ionização) 3. - Informar na solicitação corretamente todas as condições cromatográficas: Eluentes, concentração da amostra, solvente utilizado para solubilizar amostra, volume de injeção, gradiente cromatográfico, comprimentos de onda a serem monitorados (máximo 2 comprimentos), coluna, temperatura do forno, fluxo, faixa de aquisição de m/z, etc. - Enviar cromatograma quando disponível. - Caso deseje reproduzir uma condição cromatográfica já testada em seu laboratório favor informar, além das informações acima (formulário), o volume injetado e outras informações relevantes para reprodução da análise (incluindo condições de MS, se houver). HPLC-UV - quantificação - Fornecer os padrões utilizados para construção da curva de calibração já preparados nas concentrações (mg/ml) desejadas, utilizando solventes grau HPLC (Acetonitrila, Metanol ou Água). -Enviar amostra solubilizada e pronta para injeção. Utilizar solvente grau HPLC para o preparo das amostras (não utilizar solventes P.A. devido à presença de impurezas detectáveis). - Informar na solicitação corretamente todas as condições cromatográficas: Eluentes, concentração da amostra, solvente utilizado para solubilizar amostra, volume de injeção, gradiente cromatográfico, comprimentos de onda a serem monitorados (2 comprimentos), coluna, temperatura do forno, fluxo, etc.
3 Nano HPLC-MS (para amostras de peptídeos/proteínas digeridas de Gel 1D ou 2D) - Amostra pode ser enviada seca (preferencial) ou solubilizada (somente em H 2 O contendo 0,1% ácido fórmico). - Antes da digestão das amostras quantificar as proteínas pelo método de Bradford. Utilizar esse valor como referência para calcular a concentração dos reagentes para a digestão tríptica. Isso evita que no resultado da sua análise conste apenas a presença de tripsina. - Cuidado ao manipular sua amostra para evitar a contaminação com queratina. - Realizar um teste positivo com a digestão de BSA (informar a concentração de BSA de partida) e enviar junto com as amostras a serem analisadas (a amostra de BSA é um controle exigido por nós e sua análise não será cobrada). - Utilizar solvente grau HPLC ou grau HPLC-MS e H 2 O deionizada (resistividade maior que 18 MΩ.cm ou condutividade menor que 4,5 µs/cm a 25 C) para o preparo das amostras (não utilizar solventes P.A. devido à presença de impurezas detectáveis no espectrômetro de massas). -Não utilizar soluções salinas ou tampões para solubilizar a amostra. - Para o nanolcms não é necessário o envio de metodologia de separação cromatográfica. - Todas as amostras enviadas devem ser passadas no Ziptip e secas totalmente antes de ressuspender em H 2 O contendo 0,1% ácido fórmico, ou enviá-las secas. MALDI - Amostra pode ser enviada seca (preferencial) ou solubilizada (não utilizar DMSO ou outros solventes de difícil remoção). - Solubilidade: informar corretamente após realizar o teste de solubilidade - Para amostra solubilizada informar o solvente utilizado e a concentração. - Utilizar solvente grau HPLC ou grau HPLC-MS para o preparo das amostras (não utilizar solventes P.A. devido à presença de impurezas detectáveis no espectrômetro de massas) -Evitar soluções salinas para solubilizar a amostra, somente tampões voláteis são permitidos (ver Tabela 2 com os tampões e concentrações compatíveis com MALDI). Evite a presença dos compostos descritos na Tabela 3. -A Central Analítica possui as seguintes matrizes: HABA, Ditranol, THAP, DHB, DAN, AS, HCCA e 6-aza-2-Tiotimina. SE for necessário o uso de outra matriz, esta deve ser enviada pelo usuário junto com a amostra. -Para análises de MALDI-Imaging, favor consultar os analistas por (ms_ca@iq.usp.br).
4 TABELAS Tabela 1. Tampões voláteis comumente utilizados em HPLC-MS 2. Tampão Volátil pka faixa de tamponamento Faixa de concentração* Ácido Trifluoracético ,1-1% v/v Ácido Fórmico 3.8-0,1-1% v/v Formiato de amônio mm Formiato de amônio mm Ácido Acético 4.8-0,1-1% v/v Acetato de amônio mm Acetato de amônio mm 4-metilmorfolina mm Bicarbonato de amônio 6.3/9.2/ mm 1-metilpiperidina mm Acetato de trietilamônio mm Pirrolidina mm *tipicamente usa-se a faixa de mm, para evitar supressão da ionização. Tabela 2. Concentração* de componentes e contaminantes tolerados pelo MALDI-TOF 4. Componente Concentração máxima Acetato de amônio** Bicarbonato de amônio 250 mm CAPS 200 mm DTT EPPS 250 mm Glicerol 1% v/v Glicina Guanidina-HCl HEPES 100 mm Imidazol 250 mm MES 100 mm Acetato de sódio 200 mm Azida de sódio <1 mm Borato de sódio 100 mm Carbonato de sódio 200 mm Cloreto de sódio 100 mm Citrato de sódio 150 mm Fosfato de sódio 10 mm Tris 350 mm Urea * valores de referência. Podem sofrer alterações dependendo da amostra. ** quando utilizado em conjunto com SDS ou BRIJ 35, a concentração dos detergentes permitida pode chegar a 30 mm. Em qualquer outra condição os detergentes são incompatíveis com o MALDI TOF, e devem ser removidos.
5 Tabela 3. Concentração de detergentes/surfactantes tolerados pelo MALDI-TOF Detergente Concentração crítica tipo Categoria* BRIJ >0,01% v/v** Não-iônico C, D CHAPS > 0,01% v/v Zuiteriônico D CHAPSO > 0,01% v/v Zuiteriônico D n-decil-a-d-glucopiranosida n/a Não-iônico A Octil-B-D- glucopiranosida 1% v/v Não-iônico A PEG 0,1% v/v Não-iônico C SDS > 0,01% m/v** Aniônico D Tergitol NP-40 > 0,1% v/v Não-iônico C, D Thesit n/a Não-iônico D Triton X-100,-100R,-114 > 0,1% v/v Não-iônico C Tween > 0,1% v/v Não-iônico C, D * Categoria A: aceitável; Categoria B: nenhum ou pouco efeito; Categoria C: redução de sinal e qualidade do espectro afetada; Categoria D: não compatível com MALDI TOF. ** Quando utilizado em conjunto com Acetato de amônio, a concentração dos detergentes permitida pode chegar a 30 mm. Em qualquer outra condição os detergentes são incompatíveis com o MALDI TOF, e devem ser removidos. 1. Mannur V.S., Patel D., Mastiholimath V.S., Shah G. Selection of Buffers in LC-MS/MS: An Overview International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research Volume 6, Issue 1, January February 2011; Article McMaster, M.C. LC/MS: A Practical User s Guide, John Wiley & Sons, Inc. 2005, pp Annesley, T.M. Ion Suppression in Mass Spectrometry, Clinical Chemistry 49: (2003). 4. J. Chromat. A 894 (2000)
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