Estudo de Fragmentação
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- Otávio Porto Miranda
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1 Estudo de Fragmentação EI - fragmentação de alta energia (carga e radical) ESI fragmentação direcionado pela carga
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3 CID: Baixa tensão de Cone Cone de extração 5V Cone de amostra 3V Hexapolo
4 CID: Baixa tensão de Cone Cone de extração 5V Cone de amostra 7V Hexapolo Dissociação por colisão induzida ocorre antes da entrada no MS
5 In Source CID (Collision induced dissociation) Etalon 55 pg/ul, ES, FS positif, CV variables Etalon 1 22 (12.126) Cianazina 3: Scan ES+ 2.81e4 6 V Etalon (12.162) : Scan ES+ 4.19e4 4 V Etalon (12.144) 1: Scan ES e4 2 V m/z
6 Comparativo CID
7 O HO CHO OH O O OH O 48 Da OH EI e5 ESI anafr3_cid 77 (3.436) Cm (696:775) TOF MSMS 479.3ES e3 ESI m/z
8 TANDEM MS ANALYZER COMBINATIONS - Tandem-in-Space QqQ Qq-TOF MALDI-TOF-TOF - Tandem-in-Time QIT FTICR Orbitraps
9 Fonte de ionização Q1 q2 Q3 Detector Modo de análise full scan varredura seleção varredura SIM (monitoramento seletivo de íons) Products ions (íons filhos) seleção CID varredura seleção CID seleção MRM (monitoramento de reações múltiplas) Precursor ions (íons precursores) varredura CID seleção Neutral loss (perda neutra) varredura CID varredura
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11 A precursor ion is any ion selected for analysis by CAD Product ions are those fragment ions produced when the precursor ion undergoes dissociation in the collision cell during CAD A product-ion spectrum is an array of product ions produced by decomposition of a given precursor A precursor-ion spectrum is an array of precursor ions each of which is capable of generating a given product ion of a particular m/z value. A neutral-loss spectrum is an array of ions that undergoes a common loss; e.g.,expulsion of a molecule such as H2
12 Modos de Aquisição - Q Full scan MS mode: varredura: 5-35 Pesticide Mix Pest : Scan ES+ TIC 5.77e6 Pesticide Mix Pest3 256 (4.719) 1 scan : Scan ES+ 2.6e Scan m/z Pesticide Mix Pest3 432 (7.945) 1 scan : Scan ES+ 1.13e6 Pesticide Mix Pest3 582 (1.696) 1 6 scan : Scan ES+ 4.34e m/z m/z
13 Modos de Aquisição - Q Full scan MS mode Single ion recording (SIR) Q1 Q1 Fonte Detector Fonte Detector
14 Cromatograma de Full Scan Corrente iônica total Varredura de uma ampla faixa de massas. Identificação do composto de interesse dificultada pela co-eluição de compostos de mesma massa. Pós-processamento do cromatograma com extração de massa de interesse, no entanto, devido ao processo de varredura possui sensibilidade inferior que o monitoramento seletivo de íons.
15 Pós - processamento do cromatograma de full scan : Extração do íon de m/z 78 5ppm. Volatile Organic Analysis Calibration Standard. V Scan EI+ TIC 2.7e5 Area V Scan EI e4 Area Time
16 Modos de Aquisição - Q SIM ou SIR Monitoramento Seletivo de Íons Espectrômetro de Massas trabalha com seleção de uma pequena faixa de massas ou valor unitário de massa. Quanto menor a faixa de massas = maior a especificidade da análise. Mais específico que o Full Scan.
17 Espectrometria de massas sequencial Q1 q2 Q3 Fonte Detector
18 Espectrometria de massas sequencial Multiple reaction monitoring (MRM) Q1 q2 Q3 Fonte Detector O que interessa neste modo de varredura é o cromatograma.
19 Espectrometria de Massas Sequencial Q1 q2 Q3 F 1 F 2 F 3 MH + F1 MH + F 2 F 4 F 3 F 4 Ruído Sinal Íons pai Íons filhos Sinal/Ruído (UV) (MS) (LC/MS) (LC/MS/MS) (LC/LC/MS/MS) Energia de Colisão (ev)
20 Cromatograma de MRM Monitoramento de Reações Múltiplas Monitoramento de um par Precursor>Fragmento. Cromatograma muito simples = geralmente contendo um pico cromatográfico. Ideal para análise de compostos alvo em matrizes complexas. Mais seletivo e sensível que Full Scan. Mais seletivo que SIM ou SIR
21 Branco_2 1 Plasma Branco MRM of 2 Channels ES TIC 2.43e3,3,2,1 (Metronidazol) (Tinidazol) Branco_1 MRM of 2 Channels ES TIC 2.26e3, Minutes,2 Volts,1 (Amoxicilina) (Cefadroxil) Scan,,,5 1, 1,5 2, 2,5 3, 3,5 4, 4,5 5, 5,5 6, 6,5 7, Minutes 1 _ T I C e 4 teste1 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 2 Channels ES > e3 teste1 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 2 Channels ES > e S c a n _ M 2 C e l s E S + E x a t i d a o R M o f h a n n > e 4 E x a t i d a o - 1 _ 1 1 M R M o f 2 C h a n n e l s E S > e 4 teste1 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 2 Channels ES+ TIC 4.55e S c a n Scan
22 Espectro e cromatograma de MRM 15pg/ml std Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP TIC 3.52e4 15pg/ml std Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP > e3 Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP > e4 Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP > e Time MRM de 3 transições Time OBS: Modo de varredura de Quadrupolos tandem
23 Otimização das condições do MS/MS. CID_ABZ-SO1 213 (3.937) Sm (Mn, 2x1.); Cm (21:226) 1 E. colisão = 35 ev SOH Daughters of 282ES+ 5.25e CID_ABZ-SO1 32 (5.915) Sm (Mn, 2x1.); Cm (311:322) 1 E. colisão = 25 ev CH 3 OH Daughters of 282ES+ 8.9e CID_ABZ-SO1 38 (.72) Sm (Mn, 2x1.); Cm (37:46) 1 E. colisão = 12 ev C 3 H 6 Daughters of 282ES+ 9.36e CID_ABZ-SO1 1 (.185) Sm (Mn, 2x1.); Cm (1:22) 1 E. colisão= 5 ev Daughters of 282ES+ 7.81e m/z
24 p g p( ) 372SPECTS-18 1 (1.3) Scan ES+ 3.65e SPECTS-24 1 (1.3) Daughters of 287ES e m/z
25 422CPSPI3 1 (.52) Scan ES+ 1.11e CPSPI1 1 (.52) Daughters of 377ES+ 6.53e m/z
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27 Analise Multi resíduos
28 Proteoma-MS MS?
29 Gel MS
30 Sequenciamento de aminoácidos
31 Roepstorff and Fohlman in 1984 [1] and modified by Johnson in 1987
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33 Sequenciamento de aminoácidos 1: TOF MSMS 544.ES (M+H) M/z
34 1 Ionização a Pressão Atmosférica (API). Eletrospray (ESI) H S L F K F N V P ymax a y (M+H) b y H y b y b y y5 M/z y b y PV N F K F L S H bmax a y (M+H) b y H y b y b y y5 M/z y b y
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