Diálise. Eletroforese (SDS-PAGE) Sequenciamento e Identificação de proteínas

Transcrição

1 Levedura - Lise Medida de atividade total e específica (antes) Cromatografia de troca-iônica Medida de atividade total e específica (após) Diálise Eletroforese (SDS-PAGE) Sequenciamento e Identificação de proteínas Sayuri Miyamoto 2017

2 Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas Determinação da massa molecular Sequenciamento da proteína

3 Determinação de Massa Molecular da Proteína SDS-PAGE Cromatografia de exclusão Espectrometriade massas

4 Comparativo entre métodos que permitem determinação de massa SDS-PAGE Migração relativa Mr D d Precisão ± 10 % Rm =d/d Mr = massa molecular (ou peso molecular) Cromatografia de Exclusão Eluição relativa Precisão ± 1 % Espectrometria de Massas Método bastante sensível Valores de massa/carga bastante precisos Precisão ± 0.01 %

5 Como funciona a técnica? Espectrometriade Massas Espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry) é uma técnica analítica extremamente sensível que permite determinar a massa molecular. Ela também fornece informações acerca da estrutura da molécula. O equipamento que faz a medida da massa é o Espectrômetro de Massas. MALDI-TOF Q-TOF

6 Espectrômetrode Massas Características básicas de um espectrômetro de massas ALTO VÁCUO ÍONS EM FASE GASOSA SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS AMOSTRA Sample (ex. proteínas) Inlet + _ Fonte de Ionização Analisador de Massas Detector ESPETRO DE MASSAS (m/z)

7 Espectrode Massas O resultado obtido na análise por espectrometria de massas é um espectro de massas. O espectro de massa é um gráfico que mostra a abundância (intensidade) relativa de cada íon com massa/carga (m/z) definidos. Importante: o equipamento faz uma medida da razão (m/z) entre a massa do íon (m) sobre a carga do íon (z) e não da massa em si. A molécula pode ser ionizada: -pela adição de um ou mais prótons ( [M+nH + ] n+ ): modo de ionização positiva -pela perda de um ou mais prótons ( [M-nH + ] n- ): modo de ionização negativa Proteínas e peptídeos normalmente sofrem protonação e são analisados como íons carregados positivamente

8 Ionização IONIZAÇÃO (formação de íons com carga positiva ou negativa) é o primeiro passo fundamental para que a molécula possa ser introduzida no analisador de massas Duas principais técnicas de ionização BRANDAS (Soft) empregadas para análise de biomoléculas: ELECTROSPRAY e o MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization). Nobel Prize in Chemistry, 2002 John B. Fenn is the chemist who invented the ELECTROSPRAY method (1988). Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA Koichi Tanaka research engineer who developed the MALDI technique (1987). Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.

9 Ionização por Electrospray (ESI) Voet Biochemistry 3e 2004 John Wiley & Sons, Inc. Massa =(m/z x z) z Massa =(1027.6) x (100) (100) Massa= Massa =

10 Ionização por MALDI Massa =(m/z x z) z Massa =(29281 x 1) 1 Massa= 29280

11 Espectros de Massa de Proteína Intacta ESI MALDI

12 Acompanhamento de expressão e purificação de proteínas Determinação da massa molecular Sequenciamento da proteína 1-análise da composição de aa 2-análise da seq. de aa Sayuri Miyamoto 2014

13 1- Análise da composição total de aminoácidos Hidrólise de todas as ligações peptídicas em meio fortemente ácido ou básico ( 2-4 M de NaOH ou 6 M HCl) ou por enzimas (mistura de proteases) Aminoácidos sãoseparados por técnicas cromatográficas (exemplo HPLC) Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp-Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr Asp Tyr Arg His Ala Ser Thr Cys Gly Glu Asn HCl 6 M, 100C, 24h Lys Arg Ile Lys Trp Leu Derivatização pré-coluna (o-ftalaldeído, fenilisotiocianto, etc.) Asp 1 Glu 1 Asn 1 Ser 1 Gln 0 His 1 Gly 0 Thr 0 Arg 2 Ala 1 Tyr 1 Met 0 Val 0 Phe 0 Ile 1 Leu 1 Lys 1

14 2-Sequenciamento de Proteínas I. Redução de pontes de disulfeto usando agentes redutores como o 2-mercaptoetanol. É importante alquilar as cisteínas para evitar que as pontes de disulfetos se formem novamente. II. Clivagem da cadeia polipeptídica usando métodos de clivagem específicos. (ex. Proteases como a Tripsina). + H 3 N- -COO - Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg) Fragmentos Peptídicos * O uso combinado de mais de um método de clivagem ajuda no ordenamento das sequência de peptídeos, principalmente no método de Sanger

15 2-Sequenciamento de Proteínas III. Sequenciamento dos fragmentos peptídicos Degradação de Edman (Sequenciamento a partir do N-terminal) Limitado a oligopeptídeos de até 50 aa Sequenciamento através de análise por MS e/ou MS/MS MALDI-TOF Q-TOF

16 2-Sequenciamento de Proteínas Degradação de Edman (1950) Edman desenvolveu um método que permite remover aminoácidos sequencialmente a partir do N-terminal.

17 Tripsina (Cliva após resíduos básicos Lys e Arg) Como ordenar a sequência de peptídeos?? Usar mais de um método de clivagem da cadeia polippetídica... Exemplo: Quimotripsina (Cliva após resíduos aromáticos) Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr

18 INSULINA Foi sequenciada por Frederik Sanger Prêmio Nobel em

19 Degradação de Edman Sequenciadores Automáticos Limitações: Tempo de análise longo! Grande quantidade de amostra! Muito lento para os padrões de hoje!!! Hoje em dia o sequenciamento é feito por espectrometria de massas. (+rápido, requer pouquíssima amostra)

20 Espectrometria de Massas Análise de massa de Proteínas Intactas (MS) Análise de massa de Peptídeos (MS) Sequenciamento

21 Espectrometria de massas propiciou grandes avanços nas áreas de Proteômica, Glicômica e Lipidômica Wenk, M.R Cell 143, 188.

22 Sequenciamento de proteínas por espectrometria de massas

23 Busca baseada em dados de MS (PMF) Busca em Banco de Dados (ex. Mascot) Busca baseada em dados de MS/MS (sequenciamento) Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo selecionado

24 Exemplo de análise de glicosidase por SDS-PAGE e espectrometria de massas

25 Determinação da pureza e da massa molecular da glicosidase por SDS-PAGE Padrão de glicosidase

26 Determinação da massa molecular da glicosidase por MALDI-TOF Massa = Da Inte ns. [a.u.] MALDI-TOF m/z

27 Remoção da banda da glicosidase, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massa Tripsinização MALDI-TOF-TOF

28 Espetro de massa dos peptídeos da beta-glicosidase Inte ns. [a.u.] x m/z Lista de peptídeos m/z

29 Busca no Mascot utilizando as massas dos peptídeos detectados Lista de peptídeos m/z

30 Banco de Dados (Database) Swiss-Prot Se a proteína é de um organismo bem caracterizado como humanos, camundongos, levedura, ou arabdopsis, o Swiss Prot é o recomendado NCBIprot Se a proteína é de bactéria ou planta, usar o NCBIprot, pois é um banco de dados mais amplo que o Swiss-Prot

31 Modificações Modificações fixas Exemplo mais comum é a alquilação de cisteínas. O alquilante mais comum é a iodoacetamida (carbamidomethyl) ou ácido iodoacético (carboxymethyl). Modificações variáveis Exemplo: - Oxidações que ocorrem durante o processamento de amostra (oxidação de metionina) - Modificações pós-traducionais (fosforilação)

32 Scores acima de 93: significantes (p<0.05) O score obtido na busca foi de 121.

33

34

35 Busca baseada em dados de MS (PMF) Busca em Banco de Dados (ex. Mascot) Busca baseada em dados de MS/MS (sequenciamento) Massa de cada peptídeo Fragmentos de um peptídeo selecionado

36 Sequenciamento de Peptídeos baseado em MS/MS

37 Matching dos escpectros de MS/MS realizado por software MS/MS Experimental MS/MS Teórico Sequência do peptídeo

38 Resumo: Identificação de Proteínas/Enzimas 1. Determinação da massa molecular SDS-PAGE cromatografia de exclusão molecular espectrometria de massas (MALDI-TOF, Q-TOF) 2. Determinação da sequência de aminoácidos Degradação de Edman Espectrometria de massas Em ambos os casos proteínas precisam ser clivadas especificamente (ex. Proteases) para gerar peptídeos menores. A espectrometria de massas é a técnica mais precisa e mais utilizada atualmente.

39 Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli - mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos Lenhinger Proteínas são identificadas por espectrometria de massas

40 Análise Proteômica de uma Célula Eucariótica (HeLa) - mais de 2,000 proteínas identificadas espectros de MS/MS

41 Avisos: Entregar exercício 1 Resolver exercício 2 em casa Gabaritos e materiais da aula disponíveis na página do Sandro Próxima aula (20/Junho) teremos plantão de dúvidas na sala 4 Prova 2 será no dia 27/Junho no Anfiteatro Vermelho