PROTOCOLO PARA REALIZAR A BUSCA NO MASCOT

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1 PROTOCOLO PARA REALIZAR A BUSCA NO MASCOT Os resultados das análises de peptídeos digeridos serão enviados em formato mgf através do sistema da Central Analítica, ou o responsável pela amostra poderá retirar os dados brutos pessoalmente. Com o arquivo.mgf, seguir as instruções abaixo para realizar a busca no banco de dados Mascot: 1. No navegador de internet acessar o link abaixo Obs. Este link refere-se ao banco de dados que a Central Analítica possui licença, sendo possível também fazer a busca no Mascot online, dependo do tamanho dos dados obtidos. 2. Preencher os seguintes dados conforme formulário da fig. 1: a. Database(s) selecionar um ou mais banco de dados para realizar a busca (utilizar Crtl para selecionar mais de um) b. Enzima: Selecionar a enzima utilizada na digestão c. Allow up to: (selecionar o número máximo de clivagens faltantes permitidas) d. Taxonomy selecionar a taxonomia (não é necessário para o banco de dados Uniprot) e. Fixed modifications- Selecionar no quadro ao lado as todas modificações fixas e clicar na seta para passar para o quadro das modificações selecionadas (em geral é selecionado a modificação Carbamidomethyl (C)) f. Variable modifications- Selecionar no quadro ao lado todas as modificações variáveis e clicar na seta para passar para o quadro das modificações selecionadas (em geral é selecionado a modificação Oxidation (M)) g. Peptide tol* selecionar a tolerância máxima em PPM para o peptídeo (ex. 50 ppm) h. MS/MS tol* selecionar a tolerância máxima em Da para os fragmentos MS do peptídeo (ex. 0.6 Da) i. Peptide Charge: selecionar a opção 2+, 3+ and 4+ (para análises por ESI+) ou +1 (para análises por MALDI) j. Data file: Selecionar o arquivo com extensão.mgf referente ao arquivo que deseja analisar. Este arquivo será enviado através do sistema da Central Analítica, ou caso seja retirado o dado bruto processado o mesmo se encontra dentro da pasta de análise (.d), conforme fig. 2. k. Data format: Mascot generic l. Instrument: selecionar de acordo com o equipamento utilizado. ESI-QUAD-TOF para análises realizadas no Maxis 3G- Bruker MALDI-TOF-TOF para análises realizadas no UltrafleXtreme Bruker ESI-TRAP para análises realizadas no Amazon Bruker m. Report top: AUTO *Esses valores podem ser modificados de acordo com o instrumento utilizado

2 Fig. 1 Formulário para preenchimento dos parâmetros de busca

3 Fig. 2 Seleção do arquivo com extensão.mgf. 3. Clicar em Start Search a. Dependendo do banco selecionado e da complexidade dos dados, a busca pode demorar bastante. 4. O resultado será obtido na tela conforme fig. 3a a. Search parameters (ao clicar sobre a expressão a guia se abre mostrando os parâmetros da busca (fig. 3b)) b. Score distribution (ao clicar sobre a expressão a guia se abre mostrando os gráficos do score (fig. 3b)) c. Na aba proteins são listadas as proteínas identificadas e o score correspondente. d. Clicando no número da sequência correspondente é possível observar os detalhes da identificação (fig. 4)

4 Fig 3a. Tela Mascot resultados mostrados ao finalizar a busca. Fig 3b. Tela Mascot- com abas search parameters e score distribution expandidas.

5 Laboratório de Espectrometria de Massas Fig. 4. Tela Mascot- detalhes das sequências identificadas. e. Na aba Report Builder é exibida uma listagem com as proteínas identificadas na amostra. f. O arquivo pode ser exportado em formato CSV (fig.5) Fig. 5. Tela Mascot- exportação dos dados do Report Builder para CSV.

6 g. Os dados podem ser exportados também nos formatos: XML, CSV, pepxml, mzidentml, DTASelect, MascotDat File ou MGF PeakList, clicando no início da tela principal em Export. (fig.6) Fig. 6. Tela Mascot- exportação dos dados em diferentes formatos.