Análise proteômica e metabolômica por espectrometria de massas Analisadores de massas

Transcrição

1 Análise proteômica e metabolômica por espectrometria de massas Analisadores de massas Prof. Alexandre K. Tashima Departamento de Bioquímica EPM/UNIFESP

2 Bibliografia Mass Spectrometry, a Textbook. Ju rgen H. Gross, Springer 2010 Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. Michael Kinter, Nicholas Sherman, Wiley 2000

3 Espectro de massas

4 Breve histórico

5 Breve histórico Hoffmann e Stroobant, 2007

6 Prêmio Nobel Ganhador do Prêmio Nobel de Física (1906) Joseph John Thomson

7 Prêmio Nobel Ganhadores do Prêmio Nobel de Química (2002) Koichi Tanaka (SLD) John Fenn: eletrospray (ESI)

8 Aplicações da espectrometria de massas Estudo de reações em fase gasosa Estruturas moleculares Prospecção de novos fármacos Análises clínicas Análises forenses Proteômica Metabolômica Petroleômica Geoquímica Meio ambiente Paleontologia Etc.

9

10 Espectrometria de massas O princípio básico da espectrometria de massas é gerar íons de compostos orgânicos ou inorgânicos por algum método de ionização adequado, separar esses íons por suas razões massa/carga (m/z) e detectá-los qualitativamente e quantivamente por m/z e intensidade/abundância, respectivamente. Os íons podem ser átomos, moléculas, aglomerados ou seus fragmentos. A separação dos íons é efetuada pela ação de campos elétricos ou magnéticos estáticos ou dinâmicos.

11 Estrutura de um espectrômetro de massa Amostra Fonte de ionização Analisador Detector vácuo BJ SC C BJ_SC_C_b 20 (14.522) Cm (20) : TOF MSMS ES+ 2.60e % Aquisição e processamento de dados m/z Espectro de massas

12 Espectro de massas Um espectro de massas é uma representação bidimensional da intensidade do sinal (eixo y) versus m/z (eixo x). O valor de massa/carga é adimensional por definição, mas se a carga for 1 (z = 1), o valor de m/z reflete diretamente a massa do íon. A molécula ionizada detectada em sua forma intacta é chamada de íon molecular, ou íon precursor. Os íons obtidos por fragmentação do íon molecular correspondentes são chamados de íons fragmentos. Diferenças de m/z entre um íon maior e um íon menor derivados de um mesmo precursor são chamadas de perdas neutras.

13 Espectro de massas

14 VLKNKGLKTRTK Espectro de massas

15

16 Espectrômetro de massas Mede a razão massa/carga de um íon. Exemplo, a molécula de insulina bovina Massa monoisotópica: 5729,61 Da Com um próton: m + H + = 5730,61 Da m/z = 5730,61/1 = 5730,61 Massa média: 5.733,49 Da Com um próton: m + H + = 5734,49 Da m/z = 5734,49

17 Espectrômetro de massas Cadeia A da insulina bovina: GIVEQCCASVCSLYQLENYCN, m = 2337,97 Da

18 Distribuição isotópica m/z=500,29, z = 1, R=10000 m/z=999,71, z = 1, R=10000 m/z=1999,93, z = 1, R=10000 m/z=3999,89, z = 1, R=10000

19 MALDI MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ionization) Laser: N 2, 337 nm -HCCA

20 MALDI Gross, 2004

21 Electrospray wings for molecular elephants John Fenn

22 Electrospray Gross, 2004

23 Electrospray Gross, 2004

24 Electrospray: espectro da insulina m/z teórico da insulina bovina com múltiplas cargas +6 4 cargas: m/z = 1433, cargas: m/z = 1146,9 6 cargas: m/z = 955,9 7 cargas: m/z = 819,5 8 cargas: m/z = 717,

25 Analisadores de massa Uma vez produzidos, os íons em fase gasosa são separados de acordo com as suas massas (ou mais precisamente m/z). Todos os analisadores de massa usam campos elétricos e/ou magnéticos. Electric sector Magnetic sector Quadrupole Ion trap Time of flight (TOF) FTICR Orbitrap

26 detector Time of Flight - TOF Em linhas gerais, mede o tempo de vôo que um ion leva para percorrer uma determinada trajetória. O íon de maior m/z terá um tempo de vôo maior Fonte Tubo de tempo de vôo (sob vácuo) V

27 TOF analogia ao tênis Lionel Bonaventure/AFP

28 Tempo para percorrer uma distância de 2 m

29 V = 44,3 km/s, ou V = km/h Ônibus espacial km/h 20 ns

30

31 Para uma carga, a diferença de uma unidade de m/z equivale a 1 Da.

32 Resolução

33 Resolução Em uma definição geral, poder de resolução ou resolução é a habilidade que um instrumento tem de separar picos vizinhos.

34 Resolução BPP10c Carol BPP10c 299 (6.187) UE Jun :24:34 1: TOF MS ES+ 967 Definição: % m/z

35 AngioII #237 RT: 4.02 AV: 1 NL: 1.10E6 T: ITMS + p NSI E Full ms @pqd85.00 [ ] Resolucao: m/z

36 Angio Angio 224 (4.417) UE May :09:15 1: TOF MS ES+ 537 Resolucao: % m/z

37 Quadrupolo Produz um campo elétrico oscilante onde os íons são separados pela estabilidade de suas trajetórias de acordo com a razão m/z Gross, 2004

38 Quadrupolo

39 Tipos de espectrômetros de massa MALDI TOF MALDI TOF/TOF MALDI Q-TOF ESI Q-TOF ESI IT (Ion Trap) ESI LIT (Linear Ion Trap) ESI Triplo quadrupolo Etc.

40 Tipos de espectrômetros de massa Videos

41 Waters/Micromass Q-TOF

42 Tandem mass spectrometry Tandem mass spectrometry é uma definição geral que sumariza o grande número de técnicas onde íons selecionados por m/z (MS 1 ) são submetidos a uma segunda análise por espectrometria de massas (MS 2 ou MS/MS) ou análises de ordem superior (MS n ). Dissociações do íon entre uma etapa e outra podem ocorrer espontaneamente ou ativada pela aplicação de energia adicional, tipicamente por aceleração e colisão com moléculas neutras.

43 Collision Induced Dissociation (CID) Muitos espectrômetros de massas estão equipados com câmaras de colisão que podem ser quadrupolos nos quais os íons estáveis são acelerados contra um gás neutro e pouco reativo como hélio ou argônio para gerar fragmentos que sejam úteis para a elucidação estrutural dos compostos em estudo.

44 Cálculo da razão m/z (massa/carga) Exemplo, peptídeo do veneno da serpente Bothrops jararaca, BPP-10c Sequência: <ENWPHPQIPP Massa Molecular: 1195,6 Da m/z do íon + : [ M H] m / z 1196,6 1 m/z do íon 2+ : [ M 2H ] m / z 2 598,8

45 Cálculo da razão m/z (massa/carga) BPP-10c_Vera #57 RT: 0.32 AV: 1 NL: 2.12E6 T: ITMS + p NSI E Full ms [ ] [M+H] [M+2H] m/z

46 Exemplos: ácido fólico (ESI) + + H +

47 Exemplos: ácido fólico (ESI)

48 Qual é a massa dessa proteína e quais são as cargas em cada pico? Electrospray: exemplo

49 Que moléculas são essas?

50 Precursor do peptídeo LGEYGFQNALIVR Qual é a massa e a carga desse íon?

51 Detectores

52 Detectores

53 Detectores