A base da espectrometria de massas

Transcrição

1 A base da espectrometria de massas

2 The father of MS and the first mass spectrometrist to win the Nobel Prize. Pure species and mixtures JJ Thomson's 'Plum Pudding Model' of the atom, a sphere of positive charge containing electrons

3 Mass spectra and isotopes The Nobel Prize in Chemistry 1922 "for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the wholenumber rule" Francis William Aston At the end of 1909 he accepted the invitation of Sir J.J.Thomson to work as his assistant at the Cavendish Laboratory, Cambridge, on studies of positive rays. It was during this period that he obtained definite evidence for the existence of two isotopes of the inert gas neon.

4 EI : Ionização por elétrons (Dempster e Nier)

5 Princípio Geral de EI Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma pressão típica de 10-5 torr, são bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70 ev. Ocorre principalmente a retirada ou captura de um eléctron formando íons M +. ou M -.. Íons positivos são em geral predominantes (~100 vezes mais). M -. se tornam importantes para moléculas com alta EA. M + e - (70 ev) M +. (~ 5 ev) + 2e - (65 ev) ē F 1 F 2 M M + F 3 F 4

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7 Princípios Gerais Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller ). Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentam total ou parcialmente. EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a 70 ev; estável; fácil de operar; alta sensibilidade. Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas.

8 Princípios Gerais Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação excessiva), é inútil diminuir a energia dos elétrons. Uma em cada moléculas que entram na fonte de EI é ionizada. EI ocorre em ~10-16 s. Ocorre sem mudanças nas distâncias internucleares (Frank-Condon).

9 Esquema Geral

10 A diminuição da energia dos elétrons provoca uma queda brusca nas intensidades absolutas de todos os íons, mas um aumento na intensidade relativa do íon molecular.

11 Espectros Típicos de EI a 70 ev 2-Hydroxy-1,2-diphenyl-ethanone

12 OH (mainlib) 1-Octanol (mainlib) 1-Octene (mainlib) 2-Octene

13 Alguns espectros de EI apresentam dissociação excessiva, outros pouca dissociação. M +. = massa e isótopos F + = estrutura

14 Espectro de Massas: Ionização por Elétrons (EI)

15 Isômeros C 3 H 6 O

16 M-1 Perda de hidrogênio radicalar M -. H M-15 Perda de metil radicalar M -. CH 3 M-29 Perda de etil radicalar M -. C 2 H 5 M-31 Perda de metoxi radicalar M -. OCH 3 M-43 Perda de propil radicalar M -. C 3 H 7 M-45 Perda de etoxi radicalar M -. OC 2 H 5 M-57 Perda de butil radicalar M -. C 4 H 9 M-2 Perda de hidrogênio M H 2 M-18 Perda de água M H 2 O M-28 Perda de CO ou etileno M-CO ou M- C 2 H 4 M-30 Perda de formaldeido M- CH 2 O M-32 Perda de metanol M-CH 3 OH M-44 Perda de CO 2 M-CO 2 M-60 Perda de ácido acético M-CH 3 CO 2 H

17 OH Íon Molecular (mainlib) 1-Octanol (mainlib) 1-Octene

18 Chemical Ionization CI Munson and Field

19 Princípios Gerais Ionização por reação química (ex: protonação : MH + ). A exotermicidade da reação controla a extensão dos processos dissociativos. Gases ionizantes típicos: metano, isobutano, amônia. Como em EI, aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: "moléculas orgânicas". Uma aplicação típica de CI ocorre para substâncias que não apresentam o íon molecular por EI. Adutos formados entre M e o íon reagente podem ser observados (Ex. M-NH 4+ ). Estes adutos podem diferenciar isômeros. CI é uma técnica branda de ionização, por provocar pouca ou nenhuma fragmentação da molécula ionizada.

20 CI IONIZAÇÃO QUÍMICA

21 Ionização Química (CI).

22 Controle da Exotermicidade da Reação: Extensão de Fragmentação Reação Íon/molécula CH 4 + e - 70 ev + CH 4 + CH + 4 CH 3 + H + + CH 4 CH 2 + H 2 + CH 4 + CH 4 CH CH 3 + CH 3 + CH 4 C 2 H H 2 + CH 2 + CH 4 C 2 H H 2 + C 2 H CH 4 C 3 H e - + e - 50 ev térmica H 2 H

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24 Ionização Química (CI). Ionização Química Positiva: Metano: CH 4 + e -----> CH e > CH 3+ + H. CH CH > CH 5+ + CH. 3 CH CH > C 2 H 5+ + H 2 + H. Isobutano: i-c 4 H 10 + e -----> i-c 4 H e i-c 4 H i-c 4 H > i-c 4 H 9+ + C 4 H 9 +H 2 Amônia: NH 3 + e -----> NH e NH NH > NH 4+ + NH. 2 NH 4+ + NH >N 2 H + 7

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26 Reserpina EI 70 ev Reserpina CH 4 CI

27 MS?

28 APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization APPI Atmospheric Pressure Photo-Ionization

29 SIMS IONIZAÇÃO POR ÍONS SECUNDÁRIOS 1970 Benninghoven ion guns (LMIG) Ga+ and In+ Csþ ions give higher yield SF5 +, Bi + n, Au + n

30 FAB IONIZAÇÃO POR BOMBARDEAMENTO DE ÁTOMOS ACELERADOS (liquid SIMS)

31 Formação de átomos acelerados Xe + e - IONIZAÇÃO ÁTOMO LENTO Xe + ACELERAÇÃO Xe + ÍON LENTO Xe + ÍON LENTO Xe + + Xe ÍON RÁPIDO ÁTOMO LENTO ÍON RÁPIDO TROCA DE ENERGIA Xe + + Xe ÍON LENTO ÁTOMO RÁPIDO

32 Índice de popularidade - FAB

33 Matrizes

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35 Efeito da Matriz

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37 Sistema CF-FAB (continuous-flow FAB)

38 The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules" Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675. Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64. "Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,

39 Popularidade do Electrospray

40 Príncipio Geral Uma solução acidificada ou basificada da amostra (ou neutra de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino spray (aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico (+4000V ou 4000V). O contra-íon é oxidado ou reduzido e formam-se gôtas com excesso de carga (positiva ou negativa). O solvente das gôtas evapora com redução de volume, e as gôtas se subdividem. Eventualmente, devido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons são expelidos das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).

41 O C OH HCl H 3 N + Cl - O C OH V H 3 N + O C OH ESI Positivo NH 2 NaOH H 2 N O C O - Na V H 2 N O C O - ESI Negativo

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44 Enganando as moléculas neutras com curvas Z-spray (Micromass)

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46 Fonte Z-spray ESI+, Full Scan Extracted at m/z 256 Total Run Time > 25 Hr More than 500 mg salt n = 1 n = Time

47 Fonte de ESI: Ionização sob pressão atmosférica! MS

48 Proteínas Positive ESI-MS m/z spectrum of the protein hen egg white lysozyme

49 Ionização a Pressão Atmosférica (API). Eletrospray (ESI)/Pequenas moléculas Possibilidade de formação de íons com múltiplas cargas

50 Espectros de ESI-MS típicos : Pequenas Moléculas

51 Espectros de ESI-MS típicos : Pequenas Moléculas

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53 n=(m1-1)/(m2 M1) n=( )/( ) = 14,1 M = n(m1 1) 14 ( )= 15822,8

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55 MALDI vs ESI

56 Popularidade do Electrospray

57 MS?

58 MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules" (Karas & Hillenkamp )

59 Popularidade do MALDI

60 MALDI fazendo um elefante voar!

61 MALDI fazendo um elefante voar!

62 MALDI- IONIZAÇÃO/DISSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ

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64 MALDI- IONIZAÇÃO/DISSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ

65 Matrizes (1) α-cyano-4-hydroxycinnamic acid : CCA (2) 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) : SA (3) 2,5-dihydroxybenzoic acid. Razão matriz-amostra: 100:1 a 5000:1

66 Prepara-se solução da amostra e matriz (pequenas moléculas orgânicas). O solvente é evaporado resultando em uma solução sólido-sólido que é depositada sobre a superfície da sonda. Esta solução é então irradiada com laser. Ocorre aquecimento localizado e seletivo. A matriz absorve fortemente a radiação do laser. Ocorre a evaporação rápida da matriz e a molécula ionizada (ex: MH + ) é então liberada para a fase gasosa, e acelerada em direção ao analisador de massas pelo alto potencial ( V) aplicado à sonda.

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71 Espectros e Aplicações

72 MALDI de polímeros

73 Conceitos Importantes

74 Notação dos Espectro de Massas 100 Ion Abundance (%) m/z Eixo y: Abundância % Eixo x: Relação massa/carga (m/z) Informações Estruturais Informação da Massa do Compostos

75 Algumas definições importantes Isóbaros São moléculas com diferentes elementos e mesma de massa molecular. Ex.: [C 5 H 6 O 4 ] + ; [C 6 H 10 O 3 ] +, [C 9 H 22 ] + = 130 Da Isótopos São núcleos associados ao mesmo elemento da tabela periódica (mesmo número atômico) mas com diferentes números de nêutrons. Ex: Hidrogênio, Deutério e Trítio

76 Espectro de Massas: ISÓTOPOS Elemento Carbono Hidrogênio Nitrogêio Oxigênio Enxoger Cloro Bromo Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa 12 C C H H N N O O O S S S Cl Cl Br Br 98

77 Espectro de Massas: abundância isotópica Pico monoisotópico Pico do Carbono 13

78 Espectro de Massas Ion Abundance (%) Espectro de dissociação/fragmentação Fragmentos Precursor Íon molecular m/z

79 100 C 7 H 6 O C 60.87% H 4.38% O 34.75% 120 OH 92 O 50 O (mainlib) Benzoic acid, 2-hydroxy-, methyl ester

80 Espectro de Massas: abundância isotópica 25% Para se estimar o número de carbonos em uma molécula: dividir a intensidade de A+1 por 1.1 (abundância do Carbono 13 na natureza). 25 / 1.1 = 23,7 ~ 23 átomos de carbono na molécula

81 Espectro de Massas: abundância isotópica Br - CH 3 15 uma 79 Br-CH 3 =94 81 Br-CH 3 =96 Informações: Relação m/z Presença dos isótopos Diferença de massa entre os sinais

82 Espectro de Massas: abundância isotópica Cloro Peso atômico = 35,453 Mistura de Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%) e12 % CH 3 Cl mass

83 Padrão isotópico: Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%) % CH 3 Cl % 86.0 CH 2 Cl mass mass % CHCl 3 % CCl mass mass

84 Padrões isotópicos complexos 100 % e12 Composto contendo 1 átomo de Rutênio mass e12 % Composto contendo 2 átomo de Rutênio mass Evidência do número de elementos presentes na molécula

85 Medida de Massa Molecular Ex: M = 249 C 20 H 9 + C 19 H 7 N+ C 13 H 19 N 3 O 2 + Sistemas de Baixa resolução Ex: M = 249 C 20 H C 19 H 7 N C 13 H 19 N 3 O Sistemas de Alta resolução

86 Massa Massa nominal Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através do isótopo mais abundante. Ex : M=249 C 20 H 9+ or C 19 H 7 N + or C 13 H 19 N 3 O 2 + Massa exata Massa de um íon da uma determinada fórmula empírica calculada através da massa exata do isótopo mais abaundante da cada elemento. Ex : M=249 C 20 H C 19 H 7 N C 13 H 19 N 3 O Faixa de massas - Limite superior e inferior de m/z observáveis por um dado analisador de massas.

87 Resolução Medida da habilidade de um analisador de massas de separar íons adjacentes. C 20 H 9 + C 19 H 7 N+ C 13 H 19 N 3 O 2 + C 20 H 9 + C 19 H 7 N+ C 13 H 19 N 3 O compostos diferentes Mesma massa nominal Baixa Resolução 3 compostos diferentes 3 massas exatas diferentes alta resolução

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89 Massa Exata [C 18 H 15 P] + m/z Massa exata (ppm)=10 6 (M cal. M obs )/M obs

90 Caminhos de Fragmentação

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92 Possibilidades de EI

93 Regra do Nitrogênio Contém Números ímpares de nitrogênio: Íon molecular [M]+. terá massa ímpar!! Contém Números pares de átomos de Nitrogênio ou não contém átomos de nitrogênio: Íon molecular [M]+. terá massa par!!

94 Regras do elétron impar Regras do elétron par

95 Fragmentação direcionada pelo elétron Fragmentação direcionada pela carga

96 Rearranjos