Espectrometria de Massas
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- Sandra Azevedo Pinheiro
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1 Introdução Mede as massas e abundâncias dos íons na fase gasosa. É bastante sensível e fornece informações qualitativas e quantitativas. É possível distinguir substâncias diferentes, que apresentam o mesmo tempo de retenção. Antes da separação no MS, as moléculas devem ser convertidas em íons. Os íons são separados em função de suas razões massacarga (m/z). (Adaptado de Edmond H. e Vincent S. Mass Spectrometry Principles and Applications) 1
2 Informações em um Espectro de Massas Massa Atômica Média ponderada das massas dos isótopos de um determinado elemento. MA Bromo 50,69% de 79 Br massa = 78,91834 Da 49,31% de 81 Br massa = 80,91629 Da MA = (0,5969 x 78,91834) (0,4931) x 80,91629 = 79,904 Da Massa Molecular Soma das massas atômicas. MM C 4 H 9 Br: (4 x 12,0107) (9 x 1,00794) 79,904 = 137,018 2
3 Informações em um Espectro de Massas Massa Nominal É a soma dos valores inteiros das massas dos isótopos mais abundantes de cada um dos átomos constituintes da molécula. MM C 4 H 9 Br: (4 x 12) (9 x 1) 79 = 136 3
4 Informações em um Espectro de Massas 4
5 Informações em um Espectro de Massas 5
6 Introdução Considere o espectro de massas do etilbenzeno, MM = 106 g/mol. (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental 6
7 Introdução Considere o MS do metanol CH 3 OH. Massa nominal = 12 (3x1) 16 1 = 32. m/z = 32/1 = 32. Pico mais intenso (pico base 100%). Os demais picos são em função deste. (Adaptado de Edmond H. e Vincent S. Mass Spectrometry Principles and Applications 7
8 Introdução (Adaptado de 8
9 Introdução (Adaptado de 9
10 Introdução (Adaptado de 10
11 Componentes de um Espectrômetro de Massas O ponto de partida no MS é a formação de íons no estado gasoso. Inlet Fonte de Íons Analisador Detector Alto vácuo (10 5 a 10 8 mbar) Sistema de dados 100 Depende do tipo do processo de ionização empregado. Ion Abundance (%) m/z As aplicações também são dependentes dos processos de ionização empregados. 11
12 Componentes de um Espectrômetro de Massas Alto vácuo (10 5 a 10 8 mbar Inlet Fonte de Íons Analisador Detector CG HPLC Bomba Seringa EI CI MALDI ESI APCI Quadrupolo TOF Ion Trap FT-ICR Setor Magnético Sistema de dados Ion Abundance (%) FAB m/z ICP TIS As fontes podem ser: Fontes de fase gasosa. Fontes de Dessorção. 12
13 Fontes de Ionização Fontes de Fase Gasosa A amostra é vaporizada e ionizada. Aplicadas para espécies voláteis (PE < 500 C) e termicamente estáveis. Compostos com MM < 10 3 Da. Fontes de Dessorção A amostra no estado sólido ou líquido é convertida diretamente em íons gasosos. Aplicadas para espécies não voláteis e termicamente instáveis. Compostos com MM até 10 5 Da. 13
14 Fontes de Ionização Fontes Duras Fornecem energia suficiente às moléculas para excitá-las e, durante a relaxação, produzirem fragmentos de razão m/z < que o do íon molecular. Fornecem informações acerca dos grupos funcionais (estruturais) da espécie de interesse. Fontes Moles Produzem pouca fragmentação. Fornecem informações exatas sobre a massa molecular de uma espécie de interesse. 14
15 Fontes de Ionização Espectro de uma Fonte Dura CH 3 (CH 2 ) 8 CH 2 OH ; MM = 158 g/mol m/z Espectro de uma Fonte Mole m/z (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental) 15
16 Fontes de Ionização Electron Impact (EI) Ionização por Impacto de Elétrons EI As moléculas são aquecidas em temperaturas suficientemente altas para produzirem um vapor molecular. Estas moléculas interagem com os elétrons emitidos por um filamento de W ou Re aquecido e acelerados por meio de um potencial de 70 V entre o filamento e o anodo. Assim, cerca de 0,01% das moléculas do analito (M) absorvem energia suficiente para sofrer ionização. M e M e e Os produtos primários são íons positivos monocarregados. 70 ev Íon ~55 ev 0,1 ev molecular Possui energia suficiente para sofrer fragmentação. 16
17 Fontes de Ionização Electron Impact (EI) Ionização de Impacto por Elétrons EI M e M e e Íon 70 ev ~55 ev 0,1 ev molecular (Adaptado de Vékey et. al. Medical Applications of Mass Spectrometry 17
18 Fontes de Ionização Electron Impact (EI) Ionização de Impacto por Elétrons EI ABCD = Íon Pai As demais espécies são denominadas Íons Filho. (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental) 18
19 Fontes de Ionização Electron Impact (EI) Ionização de Impacto por Elétrons EI Considere o MS do cloreto de metileno (CH 2 Cl 2 ; Massa nominal = = 84 ; m/z = 84). (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental) 19
20 Fontes de Ionização Electron Impact (EI) Ionização de Impacto por Elétrons EI Considere o MS do cloreto de 1 pentanol (Massa nominal = 88 ; m/z = 88). 44 As fontes de EI são aplicadas somente para moléculas menores que aproximadamente 10 3 Da. (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental 20
21 Fontes de Ionização Electron Impact (EI) Ionização de Impacto por Elétrons EI Considere o MS do pentobarbital (Massa nominal = 226 ; mz = 226). (Adaptado de Harris Quantitative Ch)emical Analysis 21
22 Fontes de Ionização Chemical Ionization (CI) Ionização Química CI. Os átomos gasosos da amostra são ionizados por meio da colisão com íons produzidos por bombardeamento eletrônico de um excesso de gás reagente. Os elétrons com energia suficiente produzem CH 4 e CH 5 a partir do gás reativo, CH 4. Os íons produzidos doam prótons ao analito, gerando uma MOLÉCULA PROTONADA, que geralmente é a mais abundante. CH 4 e CH 4 2 e CH 4 CH 3 H CH 4 CH 4 CH 5 CH 3 CH 3 CH 4 C 2 H 5 H 2 Harris CH 5 M CH 4 MH 22
23 Fontes de Ionização Chemical Ionization (CI) Ionização Química CI. O metano reage com elétrons de elevada energia para produzir CH 4, CH 5 e CH 2. CH 4 CH 4 CH 5 CH 3 CH 3 CH 4 C 2 H 5 H 2 As colisões entre as moléculas do analito (MH) com as espécies CH 5 ou C 2 H 5 são muito reativas e envolvem a transferência de próton ou de hidreto. CH 4 MH CH 5 CH 4 C 2 H 5 MH MH 2 C 2 H 4 C 2 H 5 MH M C 2 H 6 transferência de próton. transferência de próton. transferência de hidreto. A CI produz menos fragmentações que a EI. 23
24 Fontes de Ionização Chemical Ionization (CI) Ionização Química CI. CH 4 e CH 4 2 e CH 4 CH 3 H CH 4 CH 4 CH 5 CH 3 CH 3 CH 4 C 2 H 5 H 2 Harris CH 5 M CH 4 MH 24
25 Fontes de Ionização Chemical Ionization (CI) Ionização Química CI. Considere o MS do acetaminofeno (Massa nominal = 151 ; m/z = 151). (Adaptado de Edmond H. e Vincent S. Mass Spectrometry Principles and Applications) 25
26 Fontes de Ionização Ionização Química CI. Considere o MS do pentobarbital (Massa nominal = 226 ; mz = 226). M(C 2 H 5 ) (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis 26
27 Fontes de Ionização Considere os MS do n-butil metacrilato (Massa nominal = 142 ; MM = 142), empregando metano como gás de arraste. Identifique as fontes de ionização (EI ou CI). MM = 142 (Adaptado de Edmond H. e Vincent S. Mass Spectrometry Principles and Applications 27
28 Fontes de Ionização Ionização Química EI. Considere o MS da MAMP (Massa nominal = 245), obtido por CG-EI-MS. (Adaptado de Journal of Chromatography A, 1347 (2014) ) 28
29 Fontes de Ionização Ionização Química EI. Considere os MS das moléculas abaixo, obtidos por CG-EI-MS e identifique os respectivos espectros e as massas molares. PSEP TFMPA CPSEP (Adaptado de Journal of Chromatography A, 1347 (2014) ) 29
30 Fontes de Ionização (Adaptado de Journal of Chromatography A, 1347 (2014) ) 30
31 Cocaína: MM = 303 (Adaptado de Journal of Chromatography B, 826 (2005)
32 Cromatografia / Espectrometria de Massas Na CL o eluato gera uma grande volume de gás ao evaporar na interface entre a coluna e o MS. Estes gases devem ser retirados antes da separação dos íons. Observação: Aditivos não voláteis presentes na FM comumente empregados devem ser evitados. Dentre os componentes de um tampão que são voláteis, bem como os aditivos empregados na CL, que são compatíveis com o MS, tem-se: NH 3, CH 3 CO 2 H, CCl 3 CO 2 H, (CH 3 ) 3 N e (C 2 H 5 ) 3 N. Estes aditivos devem ser adicionados em concentrações menores que 20 mm. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis 32
33 Cromatografia / Espectrometria de Massas (Adaptado de 33
34 Cromatografia / Espectrometria de Massas A MS requer de alto vácuo, para que se evite colisões moleculares durante a separação dos íons. Cromatografia é uma técnica que requer elevadas pressões. Na CG, as fases eluídas não sobrecarregam o sistema a vácuo, pois as colunas capilares são bastante estreitas. Assim, a coluna capilar é diretamente conectada à entrada do MS por meio de uma linha de transferência aquecida. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis 34
35 Cromatografia / Espectrometria de Massas (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis 35
36 Analisadores Setor Magnético Os íons moleculares são focalizados, formando um feixe. Estes íons que focalizados são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) em função das massas de cada íon. Possui elevada precisão quando se trabalha com altas resoluções. É de difícil operação. É bastante caro. As varreduras são relativamente lentas. (Adaptado de 36
37 Analisadores Setor Magnético (Adaptado de 37
38 Analisadores - Quadrupolos Espectrômetros de Massas com Quadrupolos (Adaptado de 38
39 Analisadores - Quadrupolos Consiste de quatro cilindros metálicos paralelos nos quais se aplicam um corrente elétrica e um potencial de radiofrequência alternante. Os íons produzidos na fontes de ionização são focalizados ao centro da região entre os quatro cilindros e atravessam axialmente o quadrupolo. A trajetória dos íons são dependentes do campo elétrico produzido. Assim, apenas os íons de determinadas m/z possuirão uma trajetória estável e chegarão ao detector. A RF é variada de modo que os íons de diferentes m/z obtenham uma trajetória estável ao longo do quadrupolo. Assim, os íons chegam ao detector e geram o espectro de massas. (Adaptado de 39
40 Analisadores - Quadrupolos A trajetória dos íons no quadrupolo são helicoidais. O quadrupolo é o analisador mais empregado em espectrometria de massas. Os íons são separados em função da estabilidade de suas trajetórias em um campo elétrico criado por meio de oscilações elétricas aplicadas nos cilindros metálicos. As varreduras são rápidas. É o analisador mais barato. 40
41 Analisadores - Quadrupolos Permite o emprego de dois analisadores. Espectrometria de Massas Sequencial MS/MS Emprega-se um TRIPLO QUADRUPOLO. Possibilita três tipos de experimentos: Varredura: (MS) SIM: (MS) SEM/MRM: (MS/MS) (Adaptado de 41
42 Aquisição de Dados Scan ou Full Scan Corrente Iônica Total (TIC) Coleta os dados sobre uma faixa extensa. Fornece o máximo de informações qualitativas. Mais lento que o modo SIM. Selected Ion Monitoring SIM Coleta de dados em apenas alguns valores de massa. Fornece os melhores resultados quantitativos. 42
43 Aquisição de Dados Monitoramento de Reações Múltiplas: Multiple Reaction Monitoring MRM Seleciona-se um íon precursor, que é selecionado em Q1 entre os vários íons gerados na fonte de ionização. Este íon é destruído por meio de um processo de dissociação induzida por colisão na câmara de colisão (Q2), gerando outros íons fragmentados (específicos). Em Q3 são selecionados os íons fragmentados em Q2. Possibilita um aumento de seletividade e sensibilidade. 43
44 Aquisição de Dados 44
45 45 (Adaptado de
46 Analisadores - Quadrupolos (Adaptado de
47 Analisadores - Quadrupolos Permite o emprego de dois analisadores. Espectrometria de Massas Sequencial MS/MS Emprega-se um TRIPLO QUADRUPOLO. Possibilita três tipos de experimentos: Varredura: (MS) SIM: (MS) SEM/MRM: (MS/MS) (Adaptado de 47
48 Analisadores Triplo Quadrupolo Espectrometria de Massas Sequencial MS/MS (Adaptado de 48
49 Analisadores - Quadrupolos Espectrometria de Massas Sequencial MS/MS (Adaptado de 49
50 Dissociação Induzida por Colisão CID O íon colide com um gás, gerando a fragmentação. Resolve problemas de coeluição. A quantidade de fragmentos formados é dependente da energia de colisão na câmara. 50
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