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1 Aspectos fundamentais de EM Ionizar é preciso: (a) ionização da amostra direta ou indiretamente; (b) método tradicional: ionização por impacto de elétrons resultando na formação de M seguida de fragmentação induzida por excesso de energia interna do íon molecular; (c) ionização química: método mais suave de ionização resultante de uma reação, em fase gasosa, entre íons e moléculas neutras; (d) outros métodos mais recentes. Analisar m/z é preciso: Cenas dos próximos capítulos!!

2 Espectro de massas (ionização por elétrons) de uma substancia simples i) Identificação do íon molecular (massa nominal), M.. ii) Identificação do pico base (m/z 77). iii) Identificação do íon m/z 105, (M-16)

3 Identificação da substancia e das fragmentações principais observadas no espectro de massas

4 Ionização por MALDI Analito depositado numa matriz orgânica, que possui absorção intensa no do laser ( = 337 nm para laser de N 2 ); Dessorção por um laser pulsado (ns) de alta intensidade; Espectro resultante inclui íons (MH), e outros com prótons adicionais, retirados da matriz.

5

6 Relative Abundance Espectro de um anticorpo monoclonal MALDI TOF spectrum of IgG MH (M2H) (M3H) Mass (m/z)

7 Espectro (MALDI) de poli-metil metacrilato <M> = 7100 Da

8 Espectro de complexo de Pt obtido por ionização MALDI

9 Polysulfated-Derived Oligosaccharides Positive-ion (a) and negative-ion (b) MALDI mass spectra of CS-D tetra with pmg.

10 Aplicações de MALDI Identificação de proteínas de elevada massa molecular ( > Da). Espectros de proteínas grandes apresentam íons [MH], [M2H] 2, e [M3H] 3. Proteínas pequenas apresentam espectros apenas com [MH]. Alta sensibilidade. Espectros de polímeros sintéticos. Imagem por espectrometria de massas!!

11 IMS allows for distinction of different molecular species of β-amyloid plaques in an Alzheimer's disease model. Seeley E H, and Caprioli R M PNAS 2008;105: by National Academy of Sciences

12 Métodos de ionização a pressão atmosférica APCI: ionização química a pressão atmosférica. APPI: ionização química por fotoionização. ESI: electrospray DESI: electrospray por dessorção DART: (direct analysis in real time).

13 APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

14 Formação de íons em APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

15 Tipo de amostras Aplicações de APCI Substancias de polaridade e massa molecular mediana: PAH, PCB, ácidos graxos, esteroides, ftalatos,... Substancias sem sítios ácidos ou básicos. Substancias contendo heteroátomos: uréias, carbamatos,.. Substancias a serem evitadas: substancias instáveis a temperaturas mais altas, massa molecular elevada,...

16 Exemplos de espectros obtidos por APCI no modo positivo e no modo negativo

17 APPI (atmospheric pressure photoionization)

18 Espectro de massas obtido no modo negativo por APPI

19 Espectro de massas de íons positivos obtido por APPI de petróleo venezuelano (cortesia do líder imortal HC)

20 ESI electronspray ionization Pressão atmosférica Regiões de vácuo Capilar borossilicato Solução ~10-5 M Cone de Taylor fissão íons solvatados íons sem solvente ver 1-10 kv N 2 para dessolvatação

21 Procedimento típico em ionização electrospray Substancia dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol, é injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar. Íons são formados a partir das gotas a pressão atmosférica e formam um jato por expansão livre. O mecanismo exato ainda é objeto de especulações. Amostragem ocorre através de um skimmer, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro. Íons provenientes de macromoléculas possuem freqüentemente um numero elevado de cargas. Espectros de massa medem a relação m/z e portanto íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com instrumentos menos sofisticados. A medida de distribuição de cargas não é sempre trivial. O número de cargas pode depender do ph, da presença de sais, desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc.

22 Solução NaBF 4 em metanol/água

23 Fe(CN) 6 4- e Fe(CN) 6 3-

24 Fe(CN) 6 4- e Fe(CN) 6 3-

25 ESI de macromoléculas

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27

28

29 Espectro de massas pela técnica de electrospray de uma enzima: espectro indica as cargas dos íons e M = Da

30 MH n n M=? n=?

31 Variação do espectro de massa por electrospray, em função do ph, da mioglobina

32 Determinação do número de cargas e de M em espectros contendo íons com cargas múltiplas a) Em espectros electrospray, a massa de um íon m 1 com carga z 1 pode ser equacionada em termos da massa da molécula (M) e da massa do próton (m p ) m 1 z 1 = M z 1 m p b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente de m/z, podemos equacionar a massa m 2 como m 2 (z 1 j) = M (z 1 j) m p c) Resolvendo as duas equações, z 1 M j( m ( m z ( m m 1 m 1 p ) m ) p )

33 Comparação entre métodos de ionização: exemplo da cafeína

34 Comparação entre métodos de ionização: exemplo da budesonida (anti-inflamatório)

35

36 DESI (desorption electrospray ionization)

37 DESI (desorption electrospray ionization)

38 Métodos muito recentes DESI Espectro de massas obtido por DESI de traços de urina em papel

39 DART (direct analysis in real time)

40 Ionização DART: distinguindo entre a amostra autentica e o genérico

41

42 polaridade Comparação dos métodos de ionização n-hexano CH 2 Cl 2 metanol H 2 O

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