UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Espectrometria de Massas por Probe Electrospray Ionization (PESI- MS) com Polímero Molecularmente Impresso (MIP) para determinação de ésteres de forbol em folhas de Jatropha curcas Lidya Cardozo da Silva Orientador: Dr. Boniek Gontijo Vaz Goiânia 2018

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3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Espectrometria de Massas por Probe Electrospray Ionization (PESI- MS) com Polímero Molecularmente Impresso (MIP) para determinação de ésteres de forbol em folhas de Jatropha curcas Lidya Cardozo da Silva Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Química. Orientador: Dr. Boniek Gontijo Vaz Goiânia 2018

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6 AGRADECIMENTOS Aos meus familiares pelo apoio, amor e carinho a mim dedicados. Especialmente aos meus pais que não mediram esforços no auxílio à minha formação. Ao meu orientador, Dr. Boniek Gontijo Vaz, pela confiança, incentivo e por proporcionar excelentes condições de trabalho em um laboratório bem equipado que possibilitou a realização deste trabalho. Aos meus colegas de trabalho do LaCEM pela amizade e cooperação. À Embrapa Agroenergia pelas amostras cedidas. À CAPES pelo apoio financeiro e ao programa de pós-graduação em Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás. A todos que contribuíram para minha formação e concretização deste trabalho.. vi

7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... ix LISTA DE TABELAS... xi LISTA DE ABREVIATURAS, CÓDIGOS, SIGLAS E UNIDADE DE MEDIDA... xii RESUMO... xv ABSTRACT... xvi 1. INTRODUÇÃO Espectrometria de Massas Fontes de Ionização Espectrometria de Massas Ambiente Probe Electrospray Ionization (PESI) MIPCPESI Ésteres de forbol em Jatropha curcas OBJETIVOS Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Amostras Materiais e Reagentes Preparo de amostras Caracterização das amostras Desenvolvimento do método MIPCPESI Determinação de ésteres de forbol por MIPCPESI-MS Desempenho analítico do método RESULTADOS E DISCUSSÕES Caracterização das amostras vii

8 4.2. Caracterização do MIPCPESI Determinação de ésteres de forbol por MIPCPESI (+) MS Desempenho analítico do método MIPCPESI-MS CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS viii

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema geral de um espectrômetro de massas Figura 2. Esquema da análise MIPCPESI-MS Figura 10. Espectro MIPCPESI (+) IT-MS branco no qual não foram detectados picos referentes aos ésteres de forbol Figura 11. Gráfico de barras comparando as intensidades obtidas em espectro de massas para o forbol 12,13-diacetat de m/z 449 e para os íons deoxiforbóis de m/z 347, 329 e 311 em análises de extratos metanólicos de folhas tóxicas de J. curcas usando MIP e NIP acoplados com PESI (+) MS em modo Full scan. Barras de erro apresentam o desvio padrão das análises feitas em triplicata. 25 Figura 12. Comparação entre espectros de extratos metanólicos de folhas tóxicas de J. curcas obtidos por MIPCPESI (+) MS e PESI (+) MS. Análises foram feitas no espectrômetro de massas Ion Trap LCQ Fleet em modo Full scan.. 26 Figura 13. Gráfico de barras comparando as intensidades obtidas em espectro de massas para o PDA e para os íons 12-deoxiforbol de m/z 347, 9,12- dideoxiforbol de m/z 329 e 4,9,12-trideoxiforbol de m/z 311 em análises de folhas tóxicas de J. curcas usando MIPCPESI (+) - MS e PESI (+) MS tradicional em modo Full scan. Barras de erro apresentam o desvio padrão das análises feitas em triplicata Figura 14. Espectros MIPCPESI (+) MS/MS dos íons atribuídos ao forbol 12,13-diacetato (a), 12-deoxiforbol (b), 9,12-dideoxiforbol (c) e 4,9,12-trideoxiforbol (d) Figura 15. Propostas de fragmentação para o íon forbol 12,13-diacetato de m/z 449 a partir da ionização em dos grupos éster (a) e ionização em um dos grupos hidroxila (b) Figura 16. Mecanismos de fragmentação propostos para o íon 12-deoxiforbol, [C 20 H 26 O 5 + H] +, de m/z Figura 17. Mecanismos de fragmentação propostos para o íon 4,12- dideoxiforbol, [C 20 H 24 O 4 + H] +, de m/z 329 a partir da ionização em dois diferentes sítios de ionização Figura 18. Proposta de fragmentação para o íon 4,9,12-trideoxiforbol, [C 20 H 22 O 3 + H] +, de m/z ix

10 Figura 20. Curva analítica construída a partir das intensidades do íon fragmento m/z 391 com relação às concentrações de PDA adicionadas às amostras em espectros de massas MIPCPESI (+) MS/MS x

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Valores de precisão e exatidão obtidos para análises MIPCPESI para as concentrações de PDA de 5, 15 e 25 µg.ml Tabela 2. Concentrações de forbol 12,13-diacetato determinada nos genótipos de J. curcas em análises MIPCPESI (+) MS/MS xi

12 LISTA DE ABREVIATURAS, CÓDIGOS, SIGLAS E UNIDADE DE MEDIDA 113F Código da amostra genótipo 113 de folha tóxica 169F - Código da amostra genótipo 169 de folha não tóxica 170F - Código da amostra genótipo 170 de folha não tóxica 183F - Código da amostra genótipo 183 de folha não tóxica 199F - Código da amostra genótipo 199 de folha tóxica 259F - Código da amostra genótipo 259 de folha tóxica ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária APCI Atmospheric pressure chemical ionization (ionização química à pressão atmosférica) API Atmospheric pressure ionization (ionização à pressão atmosférica) APPI Atmospheric pressure photo ionization (foto ionização à pressão atmosférica) CA Concentração analisada CI Chemical Ionization (ionização química) CID Collision-induced dissociation (Dissociação induzida por colisão) CMD Concentração média determinada CN Concentração nominal DART Direct analysis in real time (análise direta em tempo real) DESI Desorption electrospray ionization (dessorção por eletrospray) DP Desvio padrão DPR Desvio padrão relativo EI Electron Impact (impacto por elétrons) ESI Electrospray Ionization (ionização por eletrospray) EUA Estados Unidos da América ev eletro Volts FAB Fast atom bombardment (bombardeamento de átomos rápidos) HCl Ácido clorídrico IC Inclinação da curva IE Incerteza expandida IT analisador Ion Trap (armadilha de íons) J. curcas - Jatropha curcas xii

13 K fator de abrangência kv quilovolts (10 3 Volts) LOD - Limite de detecção LOQ - Limite de quantificação MALDI Matrix-assited laser desorption ionization (ionização/dessorção a laser assistida por matriz) MAPA Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento MEV Microscopia eletrônica de varredura mg mili grama (10-3 grama) Min minuto (s) MIP - Molecularly Imprinted Polymer (Polímero Molecularmente Impresso) ml mili Litro (10-3 Litro) mmol mili mol (10-3 mol) MS - Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas) MS/MS Espectrometria de massas Tandem m/z razão da massa sobre a carga NIP - Non-Imprinted Polymer (Polímero Molecularmente não Impresso) nº - número P Nível de confiança PDA - phorbol 12,13-diacetate (forbol 12,13-diacetato) PEs Phorbol esters (ésteres de forbol) PESI - Probe Electrospray Ionization (Ionização por Eletrospray em Haste) PMA phorbol 12-myristate 13-acetate (forbol 12-miristato 13-acetato) ppm parte por milhão PSI Ionização por paper spray R 2 coeficiente de determinação da regressão linear RDC Resolução da Diretoria Colegiada SDS Dodecil sulfato de sódio SIMS Secondary ion Mass Spectrometry (espectrometria de massas de íon secundário) SRM Single reaction monitoring (monitoramento de reação selecionada) TEOS Tetraetoxisilano V - Volts xiii

14 C graus Celsius µg.g -1 micro grama (10-6 grama) por grama µg.ml -1 micro grama (10-6 grama) por mililitro (10-3 Litro) xiv

15 RESUMO A Jatropha curcas L. é uma oleaginosa euforbiácea considerada tóxica para humanos e animais devido à presença de ésteres de forbol (PEs). Tradicionalmente, a detecção destes compostos tóxicos tem sido feita em tortas e sementes de J. curcas por meio do uso de técnicas de separação cromatográfica como HPLC-UV e HPLC-MS que apesar de eficientes são laboriosas e requerem alto consumo de tempo e solventes. Dessa forma, seria interessante o desenvolvimento de novas técnicas analíticas para determinação desses compostos com maior praticidade. Probe electrosrpay ionization (PESI) é uma das técnicas de ionização utilizadas na espectrometria de massas ambiente que permite análises rápidas com mínimo preparo de amostras. No entanto, para análise de amostras complexas essa técnica apresenta baixa sensibilidade e supressão iônica. Neste estudo, foi desenvolvido um método de análise por espectrometria de massas por Probe electrospray revestido com polímero molecularmente impresso (MIPCPESI-MS) para determinação de ésteres de forbol em extratos metanólicos de folhas de Jatropha curcas com extração direta da fonte de ionização. O polímero molecularmente impresso (MIP) sintetizado mostrou-se adequado para extração de PEs em extratos metanólicos de folhas de J. curcas tendo melhor desempenho como fase extratora quando comparado ao polímero não molecularmente impresso (NIP). O método MIPCPESI- MS possibilitou a detecção do forbol 12,13-diacetato (PDA) e de outros três íons metabólitos presentes nas folhas de J. curcas com mínimo preparo de amostras e com maior intensidade de sinais quando comparado às análises com PESI convencional. Para o PDA, a curva de calibração apresentou linearidade com R 2 > 0.99, LOD e LOQ na faixa de µg.ml -1, valores de precisão entre 4.06 e % e exatidão entre e %. Posteriormente, o método MIPCPESI foi empregado na quantificação de PDA em seis extratos metanólicos de diferentes genótipos de folhas de J. curcas resultando em valores concentrações entre ± a ± µg.g -1 nas amostras tóxicas. xv

16 ABSTRACT Jatropha curcas L. is a euphorbiaceous oilseed plant considered toxic to humans and animals due to the presence of phorbol esters (PEs). Traditionally, the detection of these toxic compounds has been done in J. curcas seeds and derivates via chromatographic separation methods such as HPLC-UV and HPLC-MS. Although efficient, these techniques are laborious and require high time and solvent consumption, thus it would be interesting the development of new analytical methods to determine these compounds with more practicality. Probe electrospray ionization is frequently used in ambient mass spectrometry allowing analysis with minimum sample preparation. However, for complex samples analysis, this technique presents low sensitivity and ionization suppression. In this study, a molecularly imprinted polymer-coated probe electrospray ionization mass spectrometry (MIPCPESI-MS) method was developed for determination of phorbol esters in methanolic extracts of Jatropha curcas leaves with direct extraction form the ionization source. The synthesized molecularly imprinted polymer (MIP) proved to be adequate for extraction of the PEs in methanolic extracts of J. curcas leaves with better performance as extraction phase in comparison with the non-imprinted polymer (NIP). The MIPCPESI method allowed detection of phorbol 12,13-diacetate (PDA) and other three PEs metabolite ions from Jatropha leaves with minimal sample preparation, and with higher signal intensities compared to analysis with conventional PESI. For the PDA, calibration curve exhibited linearity with R 2 > 0.99, LOD and LOQ in µg.ml -1 range, precision and accuracy values, respectively, between 4.06 to 13.49% and to %. Finally, MIPCPESI was employed for PDA quantification in methanolic extracts of six different J. curcas leaves genotypes resulting in concentrations ranging from ± to ± µg.g -1 for toxic samples. xvi

17 INTRODUÇÃO 1

18 1. INTRODUÇÃO 1.1. Espectrometria de Massas A espectrometria de massas (MS) é uma das técnicas analíticas mais sensíveis sendo de grande aplicabilidade na identificação e quantificação de uma grande variedade de compostos (MA & OUYANG, 2016). Desde os primeiros estudos de J. J. Thomson, a espectrometria de massas é aperfeiçoada e ganhou posição de destaque dentre outras técnicas analíticas por possibilitar análises de misturas complexas e de analitos em níveis traço de concentração (HOFFMANN & STROOBANT, 2007; OUYANG & ZHANG, 2010). Basicamente, uma análise em espectrometria de massas consiste na geração de íons na fonte de ionização, seguida da separação dos íons no analisador por efeito de campo elétrico ou magnético; por fim, os íons são detectados por suas respectivas razões massa carga (m/z) e abundância (GROSS, 2004). Na Figura 1 é apresentado o esquema geral de um espectrômetro de massas mostrando seus principais componentes. Vácuo Fonte de ionização Analisador Detector Introdução de amostras Processamento de dados Figura 1. Esquema geral de um espectrômetro de massas. Devido ao fato de que a espectrometria de massas mede a razão massa carga (m/z) de moléculas ionizadas, a técnica utilizada na ionização dos analito é um dos fatores que determinam sua versatilidade (COOKS, et al., 2006) Fontes de Ionização Análises tradicionais de MS envolvem técnicas de ionização sob condições de vácuo, tais como, impacto por elétrons (EI) e ionização química (CI) que possibilitaram análise de compostos voláteis pela identificação das massas 2

19 moleculares e de seus fragmentos (OUYANG & ZHANG, 2010). Ademais, técnicas de ionização por dessorção como a espectrometria de massas de íon secundário (SIMS), o bombardeamento de átomos rápidos (FAB), e a ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) tornaram possível a ionização de compostos não voláteis (COOKS, et al., 2006; PAVIA, et al., 2010). Além de possibilitar análise de peptídeos e proteínas, técnicas como MALDI e SIMS tornaram-se os pilares de técnicas de ionização que acessam informação composicional diretamente da superfície da amostra (BERKEL, et al., 2008). Apesar de bem estabelecidas, as técnicas de ionização que operam sob condições de vácuo podem tornar laboriosa a forma de introdução de amostras, exigindo maior preparo (BERKEL, et al., 2008; COOKS, et al., 2006). Dessa forma, o surgimento de técnicas de ionização à pressão atmosférica (API), tais como, a ionização por eletrospray (ESI), a ionização química à pressão atmosférica (APCI) e a foto ionização à pressão atmosférica (APPI) causaram uma revolução na espectrometria de massas, possibilitando ionização branda de forma mais simples (ALBERICI, et al., 2010). As técnicas API aumentaram a aplicabilidade da espectrometria de massas, tornando possível a ionização de amostras reais em misturas complexas e níveis traço sob condições de pressão atmosférica (MONGE, et al., 2013). No entanto, ainda são necessárias etapas de pré-tratamento da amostra, tais como, o preparo de soluções, etapas de extração, separação e derivatização (ALBERICI, et al., 2010). As novas possiblidades advindas das fontes API despertaram o interesse por fontes de ionização mais versáteis que possibilitassem o emprego da espectrometria de massas no mundo real, dessa forma, abriram espaço para o surgimento das fontes de ionização ambiente, que constituíram uma segunda revolução na espectrometria de massas ao possibilitar análises diretas com mínimo ou nenhum preparo de amostras (MONGE, et al., 2013; ALBERICI, et al., 2010) Espectrometria de Massas Ambiente A Espectrometria de Massas Ambiente é constituída por um conjunto de técnicas de ionização que operam sob condições de pressão atmosférica e 3

20 temperatura ambiente que possibilitam a introdução e ionização direta de amostras (COOKS, et al., 2006; HUANG, et al., 2010). As primeiras fontes de ionização ambiente desenvolvidas foram a dessorção por eletrospray (DESI) em 2004 e a análise direta em tempo real (DART) em 2005, desde então, um grande número de fontes de ionização ambiente foram desenvolvidas e aplicadas a uma grande variedade de amostras, gerando centenas de publicações (OUYANG & ZHANG, 2010). O desenvolvimento das técnicas empregadas na espectrometria de massas ambiente se deu com base em um grande conhecimento acumulado dos métodos clássicos de ionização (ALBERICI, et al., 2010). Dessa forma, a maior parte das técnicas ambientes tem princípios de ionização análogos aos mecanismos apresentados nas fontes de íons já existentes, tais como, ESI, APPI, sonic spray ou CI (MONGE, et al., 2013). ESI é uma das técnicas de ionização mais comumente adaptadas no desenvolvimento de fontes de ionização ambientes (HUANG, et al., 2010). Na ionização por eletrospray os íons são formados em solução e escoados em um capilar onde é aplicada uma alta voltagem e a formação de um campo elétrico auxilia na dessolvatação das gotas (FENN, et al., 1990). Técnicas de ionização ambientes com mecanismo análogo à ionização por eletrospray podem ser aplicadas para análise direta das amostras que seriam analisadas por ESI. Dessorção/Ionização por eletrospray (DESI), Paper Spray Ionization (PSI) e Probe electrospray ionization (PESI) são exemplos de técnicas ambientes com mecanismos de ionização análogos ESI que possibilitam até mesmo a ionização de macromoléculas com mínimo ou nenhum preparo de amostras Probe Electrospray Ionization (PESI) A ionização por Probe Electrospray (PESI) foi desenvolvida para análise de amostras líquidas usando uma agulha sem o capilar onde é aplicada uma voltagem (~3 kv) para emissão do eletrospray (HIAROKA, et al., 2007). Nesta técnica, a agulha de ionização é colocada em contato com a amostra e aplicação de altas voltagens permite a ionização direta sob condições ambientes e sem o uso de gases de auxílio, bainha ou nebulização (CHEN, et al., 2008). 4

21 PESI é uma técnica de ionização ambiente análoga ao ESI. Portanto, tem ampla aplicabilidade podendo ser empregada em amostras reais para análise de amino ácidos, peptídeos e proteínas, de maneira direta e com maior praticidade do que pelas técnicas tradicionais (CHEN, et al., 2008; ZAITSU, et al., 2016; HAYASHI, et al., 2017). Além dessas vantagens, PESI é uma técnica livre de problemas de entupimento do capilar e pode ser facilmente montada em laboratório. Apesar de todas as vantagens da técnica, assim como na ionização por ESI, PESI apresenta baixa seletividade do analito e sofre com efeito de supressão iônica. Dessa forma torna-se laboriosa a realização de análises diretas de analitos em matriz complexa sem que as amostras sejam previamente tratadas e métodos de extração e separação sejam empregados MIPCPESI Como forma de contornar as dificuldades de análise provenientes da supressão iônica e baixa seletividade da ionização por probe electrospray, é proposta neste trabalho, a utilização de um polímero molecularmente impresso (MIP) acoplado à agulha do PESI para promover extração direta da fonte de ionização. Na Figura 2 é apresentado um esquema de análise por MIPCPESI-MS. Agulha kv Solvente MIPCPESI MIP Spray MS Etapa de extração durante a amostragem Figura 2. Esquema da análise MIPCPESI-MS. A montagem do MIPCPESI consiste no recobrimento de 1 cm da agulha de ionização com um polímero molecularmente impresso. A utilização do MIP possibilita 5

22 a realização de uma etapa de extração durante o carregamento da amostra na fonte de ionização. Polímeros molecularmente impressos são preparados a partir da copolimerização de monômeros funcionais e agentes reticulantes na presença de moléculas molde (MURRAY & ÖRMECI, 2012). Após a polimerização, as moléculas do molde são removidas deixando sítios seletivos para extração de moléculas alvo em matrizes complexas (SALEHI, et al., 2016). Cavidades molecularmente impressas conferem aos MIPs a habilidade de seletivamente se ligar a moléculas utilizadas como molde durante sua síntese ou à moléculas com estrutura semelhante. Devido a isso, os polímeros molecularmente impressos são utilizados como fase estacionária em colunas cromatográficas e em cartuchos de extração em fase sólida (SALEHI, et al., 2016; SONG, et al., 2012; ANENE, et al., 2016; MADIKIZELA & CHIMUKA, 2016). Além destas aplicações, existem trabalhos onde polímeros molecularmente impressos são utilizados em conjunto com técnicas de espectrometria de massas ambiente proporcionando extração seletiva para grupos de compostos diretamente da fonte de ionização (PEREIRA, et al., 2018). No entanto, ainda não existem relatos na literatura do acoplamento de polímeros molecularmente impressos com a técnica de probe eletrospray. Portanto, para demonstrar a eficiência do MIPCPESI, neste trabalho um polímero molecularmente impresso seletivo à ésteres de forbol foi sintetizado e fixado à agulha de ionização para determinação de PEs em extratos metanólicos de folhas de Jatropha curcas Ésteres de forbol em Jatropha curcas A Jatropha curcas é uma oleaginosa da família Euphorbiaceae encontrada em regiões tropicais e subtropicais (NAKAO, et al., 2015). Suas sementes consistem em 30-40% de óleo que propicia seu uso na produção de biodiesel. O óleo é extraído das sementes gerando uma torta rica em proteínas (53-63%) com alto potencial de aplicação na alimentação animal podendo agregar valor a cadeia produtiva do biodiesel (HASS, et al., 2002). No entanto, J. curcas e seus derivados são consideradas tóxicas devido à presença de fatores antinutricionais e ésteres de forbol (PEs) que exibem atividades biológicas associadas à promoção de tumores 6

23 por mimetizarem a ação do diacilglicerol (DAG), ativador da proteína C quinase, que no organismo regula diferentes vias de transdução e outras atividades metabólicas (DEVAPPA, et al., 2010). PEs são ésteres diterpenos que tem em comum a presença do núcleo tigliano em sua estrutura; reações de hidroxilação em diferentes posições levam à formação de diferentes ésteres de forbol (GOEL, et al., 2007). Dessa forma, diversas estruturas foram identificadas em derivados de J. curcas (HASS, et al., 2002). Pesquisas têm sido desenvolvidas com o objetivo de reduzir ou eliminar ésteres de forbol dos derivados de Jatropha curcas (Kongmany, et al., 2014; Hidayat, et al., 2014). Neste sentido, a Embrapa Agroenergia têm produzido novos genótipos de J. curcas visando cultivares não tóxicos com alto teor de óleo, o que torna necessário o uso de técnicas analíticas para diferenciar genótipos tóxicos e não tóxicos (Laviola, et al., 2018a; Laviola, et al., 2018b). Tradicionalmente a detecção dos ésteres de forbol é feita utilizando as sementes, sendo necessário que o cultivar atinja a idade de produção destas. Além disso, técnicas de extração e separação são comumente empregadas e a diferenciação dos genótipos é feita via análises HPLC-UV e, mais recentemente, HPLC-MS (BALDINI, et al., 2014). A detecção dos ésteres de forbol diretamente nas folhas é uma possibilidade vantajosa, pois diminui o tempo necessário para diferenciação dos genótipos. No entanto, se trata de um verdadeiro desafio analítico uma vez que em relação às sementes, a concentração de PEs é cerca de 10 vezes menor nas folhas (BALDINI, et al., 2014; MAKKAR, et al., 2012). Dessa forma, seria interessante o desenvolvimento de novas técnicas analíticas para determinação destes compostos com maior praticidade e que possibilitem a diferenciação dos genótipos previamente nas folhas. Devido a isso, neste trabalho foi desenvolvido um novo método que permite a detecção de PEs e diferenciação dos genótipos de maneira precoce ainda nas folhas de Jatropha curcas. A metodologia desenvolvida neste trabalho consiste do acoplamento de um polímero molecularmente impresso seletivo a ésteres de forbol com a técnica de Probe electrospray ionization. O MIP acoplado à haste metálica promove etapa de extração direta da fonte de ionização para detecção e 7

24 quantificação de PEs de maneira simples e sem o uso de métodos cromatográficos de separação. 8

25 OBJETIVOS 9

26 2. OBJETIVOS O objetivo geral deste trabalho consiste na síntese de um polímero molecularmente impresso seletivo à ésteres de forbol para o desenvolvimento MIPCPESI. Neste método, o probe electrospray é revestido com o polímero molecularmente impresso para proporcionar a extração dos analito de interesse durante a etapa de amostragem na probe de ionização. Dessa forma visa-se maior seletividade e menor supressão iônica na determinação de PEs em extratos metanólicos de folhas J. curcas e a diferenciação dos genótipos sem o uso de métodos cromatográficos de separação Objetivos específicos Como objetivos específicos têm-se: Síntese de um polímero molecularmente impresso seletivo a ésteres de forbol; Síntese de um polímero não molecularmente impresso para fins comparativos; Comparação morfologia do MIP e do NIP sintetizados e do desempenho destes polímeros como fase extratora dos compostos de interesse; Desenvolvimento e otimização da metodologia MIPCPESI para extração e ionização dos compostos de interesse em extratos metanólicos de folhas de J. curcas; Comparação do desempenho do método MIPCPESI com o método PESI tradicional como fontes de ionização em análises por espectrometria de massas; Detecção de ésteres de forbol diretamente dos extratos metanólicos das folhas de J. curcas utilizando a metodologia MIPCPESI-MS; Avaliação do desempenho analítica do método desenvolvido; Determinação quantitativa de ésteres de forbol em extratos metanólicos de folhas de J. curcas e a diferenciação das amostras tóxicas e não tóxicas utilizando a metodologia MIPCPESI-MS. 10

27 MATERIAIS E MÉTODOS 11

28 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Amostras Amostras das folhas rotuladas como tóxicas e não tóxicas de diferentes genótipos de Jatropha curcas foram cedidas pela Embrapa Agroenergia (Brasília, Brasil). Genótipos tóxicos foram identificados como 113F, 199F e 259F; amostras não tóxicas foram identificadas como 169F, 170F e 183F Materiais e Reagentes Metanol grau HPLC foi adquirido da J. T. Baker (Philipsburg, EUA). Ácido fórmico e os padrões analíticos forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e forbol 12,13- diacetato (PDA) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). Nas sínteses do MIP e NIP (polímero não molecularmente impresso) foram utilizados dodecil sulfato de sódio (SDS), etanol, tetraetoxisilano (TEOS) e amino propil trietoxisiliano (APTES) adquiridos da Sigma-Aldrich, além do ácido clorídrico (HCl) da Scharlab S. L. (Sentmenat, Espanha) Preparo de amostras Para cada amostra de folha foram preparados 3 ml de extrato metanólico a partir das folhas de J. curcas. No preparo dos extratos, 100 mg de cada folha foram colocados em tubos de micro centrífuga onde foram adicionados 1,0 ml de metanol grau HPLC. Os frascos foram colocados em banho de ultrassom por 10 min e o sobrenadante foi separado. As etapas de adição de metanol e banho de ultrassom foram repetidas por mais 2 vezes para obtenção de aproximadamente 3 ml de extrato metanólico de cada amostra Caracterização das amostras Devido à grande variedade de moléculas de ésteres forbol e produtos de degradação existentes foram feitas análises prévias dos extratos metanólicos das folhas em espectrômetro de massas de alta resolução para identificação e confirmações de quais ésteres de forbol estariam presentes em amostras tóxicas. 12

29 Análises de alta resolução foram feitas por infusão direta utilizando-se o espectrômetro de massas Orbitrap Q Exactive (Thermo Fischer Scientific) em modo positivo com ionização por eletrospray (ESI) e resolução de na faixa de massa de 200 a 800 Da. Os parâmetros da fonte de ionização foram: voltagem do capilar de 3700 V; temperatura do capilar de 275 ºC e temperatura auxiliar de 42 ºC; fluxo do gás de bainha de 10 e sem uso de gás de varredura e gás auxiliar Desenvolvimento do método MIPCPESI Para a síntese do MIP, em um Tubo Falcon foram adicionados 5,9 mmol de tetraetoxisilano usado como agente reticulante, 12,8 mmol de água, 0,03 mmol de HCl e 6,8 mmol de etanol. A mistura foi agitada e deixada em repouso por 24 horas. Em outro Tubo Falcon, foram adicionados 1,4 mmol de aminopropil trietoxisilano utilizado como monômero, 3,5 mmol de SDS e 616,2 mmol do padrão forbol 12- miristato 13-acetato (PMA) usado como molécula molde. A mistura foi agitada, adicionada à mistura preparada anteriormente e deixada em repouso por 24 horas. A síntese de um polímero molecularmente impresso ocorre na presença de uma molécula molde que ao ser removida cria sítios para extração seletiva de moléculas alvo. Na síntese do MIP, o forbol 12-miristato 13-acetato utilizado como molde foi removido com metanol em extrator Soxhlet por 48 horas conforme o esquema apresentado na Figura 3. 13

30 Figura 3. Esquema de síntese do MIP seletivo a ésteres de forbol. Um polímero não molecularmente impresso (NIP) também foi sintetizado para fins de comparação da morfologia e desempenho dos polímeros como fase extratora dos compostos de interesse em amostras complexas de folhas de J. curcas. Na síntese de um NIP são utilizados os mesmos reagentes, monômero e agente reticulante nas reações de polimerização, no entanto não é feita adição da molécula molde e o polímero sintetizado não apresenta cavidades impressas que proporcionariam interações seletivas. Portanto, a síntese do NIP ocorreu de maneira semelhante à sintetize do MIP, dispensando apenas, as etapas de adição e remoção do PMA. A morfologia do MIP e NIP sintetizados foi avaliada por meio de análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), utilizando um equipamento JSM 6610 (JEOL, Tóquio, Japão). No desenvolvimento do MIPCPESI e NIPCPESI foram utilizadas hastes de aço inoxidável de 4 cm de comprimento e 0,6 mm de diâmetro. Com uma resina epóxi, 1 cm da ponta das hastes de ionização foram recobertas com os polímeros sintetizados (Figura 4). 14

31 Figura 4. Foto do MIPCPESI Determinação de ésteres de forbol por MIPCPESI-MS A extração dos analitos de interesse foi feita diretamente na agulha de ionização. O MIPCPESI foi mergulhado em 1.5 ml dos extratos metanólicos sob agitação magnética por 10 min. Após a etapa de extração, o MIP foi lavado com água ultra purificada para redução dos demais componentes da matriz e posteriormente levado à estufa para secagem a 40 C por 30 min. As análises foram feitas em um espectrômetro de massas Ion Trap LCQ Fleet da Thermo Fischer Scientific utilizando software Thermo Tune Plus. O MIPCPESI foi posicionado em frente à entrada do espectrômetro de massas a uma distância de 5 mm e ângulo de 105º conforme mostrado na Figura 5. Figura 5. Arranjo experimental de análise com MIPCPESI-MS. 15

32 As análises foram realizadas em modo full scan para detecção dos ésteres de forbol e diferenciação dos genótipos de J. curcas. Além das análises MS também foram feitos experimentos de fragmentação (MS/MS) para confirmar a atribuição dos valores de m/z detectados aos ésteres de forbol. As curvas analíticas foram construídas utilizando-se espectrometria de massas tandem. Também foram feitas análises por NIPCPESI-MS e PESI-MS tradicional para fins de comparação. Para realização de todas as análises foi utilizada uma garra para aplicação de voltagem de 3.5 kv na fonte de ionização. Assim como no PESI tradicional, não foram gases de bainha, de varredura e auxiliar. Foi utilizada voltagem do capilar de 38 V, temperatura do capilar de 275 C, voltagem das lentes de 110 V. Para análises em modo SRM foi utilizado He como gás de colisão com energia de 20 ev Desempenho analítico do método O desempenho analítico do método MIPCPESI-MS foi avaliado com amostras da matriz branca fortificada com padrão PDA em concentrações de 1 a 30 µg.ml -1. A normativa da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) RDC n 166 que estabelece critérios para validação de métodos analíticos foi utilizada (ANVISA, 2017). A linearidade foi avaliada pela regressão linear da intensidade dos picos dos íons fragmentos no espectro de massas em função da concentração do analito. Para avaliação da precisão, foi verificada a proximidade entre os resultados obtidos por meio da repetibilidade, calculando-se o desvio padrão relativo conforme Equação 1. Onde: DPR = desvio padrão relativo DP = desvio padrão Equação 1: DPR = DP CMD. 100 CMD = concentração média determinada A exatidão do método foi verificada pela relação percentual de recuperação do analito conforme a Equação 2. 16

33 Equação 2: Recuperação = Concentração média experimental Concentração teórica. 100 As análises para determinação da precisão e exatidão do método foram feitas em triplicata, utilizando três concentrações (baixa, média e alta) dentro da faixa de linearidade. O limite de detecção (Equação 3) e o limite de quantificação (Equação 4), representando, respectivamente, a menor quantidade do analito presente na amostra que pode ser detectado e a menor quantidade do analito na amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis foram determinados. Onde: LOD = limite de detecção LOQ = limite de quantificação IC = inclinação da curva Equação 3: LOD = Equação 4: LOQ = 3,3. DP IC 10. DP IC Após a verificação do desempenho analítico do método, MIPCPESI-MS foi utilizado na determinação quantitativa do forbol 12,13-diacetato em extratos metanólicos preparados a partir de folhas de seis diferentes genótipos de J. curcas. 17

34 RESULTADOS E DISCUSSÕES 18

35 A b u n d â n c i a R e l a t i v a 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1. Caracterização das amostras Ésteres de forbol são moléculas com um núcleo tigliano presente em sua estrutura que sofrem reações de hidroxilação levando à formação de uma série de derivados (GOEL, et al., 2007). Prova disso é que uma grande variedade de ésteres diterpenos já foi identificada nos derivados de sementes e folhas de J. curcas (HASS, et al., 2002; BALDINI, et al., 2014). Devido à grande variedade de moléculas de ésteres de forbol existentes e para caracterizar as amostras, análises de ESI (+) - MS de extratos metanólicos das folhas de J. curcas foram realizadas no Orbitrap Q-Exactive, espectrômetro de massas de alta resolução, conforme condições experimentais reportadas em materiais e métodos (seção 3.4), para identificação de quais estruturas de forbol estariam presentes. O forbol 12,13-diacetato [C 24 H 32 O 8 + H] + de m/z foi detectado nas três amostras tóxicas. Na Figura 6 estão apresentados os espectros provenientes das análises dos extratos de folhas dos cultivares tóxicos (a) e a estrutura do PDA (b). (a) 100 [C 24 H 32 O 8 + H] + Erro: ppm F (b) Erro: ppm 199F Erro: ppm 259F m/z Figura 6. Espectros de ESI (+) Orbitrap-MS dos extratos metanólicos das folhas 113F, 119F e 259F (a) e estrutura do forbol 12,13-diacetato detectado nas três amostras tóxicas (b). Além do forbol 12,13-diacetato, íons deoxiforbóis derivados da remoção de átomos de oxigênio do forbol (WANG, et al., 2015) foram detectados na forma 19

36 protonada [M + H] +. Conforme apresentado na Figura 7, os íons 4,12,20- trideoxyphorbol [C 20 H 22 O 3 + H] + de m/z 311,16417 (a), 12-deoxiforbol [C 20 H 26 O 5 + H] + de m/z 347,18530 (b) e 4,12-deoxiforbol [C 20 H 24 O 4 + H] + de m/z 329,17474 (c) foram detectados nas três amostras tóxicas. 20

37 A b u n d â n c i a R e l a t i v a A b u n d â n c i a R e l a t i v a A b u n d â n c i a R e l a t i v a 100 [C 20 H 22 O 3 + H] + Erro: ppm F (a) Erro: ppm 199F Erro: ppm 259F [C 20 H 26 O 5 + H] + Erro: ppm F (b) Erro: ppm 199F Erro: ppm 259F [C 20 H 24 O 4 + H] + Erro: ppm F 199F (c) Erro: ppm F Erro: ppm m/z Figura 7. Espectros ESI (+) Orbitrap-MS mostrando a detecção dos íons [C 20 H 23 O 3 + H] + de m/z (a), [C 20 H 26 O 5 + H] + de m/z (b) e [C 20 H 24 O 4 + H] + de m/z (c) nos três genótipos tóxicos analisados. Os ésteres de forbol são moléculas instáveis que comumente sofrem perdas de grupos CH 3 COOH e H 2 O (VOGG, et al., 1999). O núcleo tigliano é comum em 21

38 todas as moléculas de PEs (HASS, et al., 2002). Devido à baixa estabilidade dos ésteres de forbol pode ocorrer fragmentação na fonte durante a ionização, além disso, em sua estrutura ocorrem comumente a perda de moléculas de H 2 O que podem levar à formação dos íons deoxiforbóis detectados conforme o mecanismo de degradação proposto na Figura 8. - H 2 O (I) Forbol C 20 H 28 O 6 12-deoxiforbol C 20 H 26 O 5 - H 2 O - H 2 O (III) (II) 4,9,12-trideoxiforbol C 20 H 22 O 3 9,12-dideoxiforbol C 20 H 24 O 4 Figura 8. Mecanismos de degradação propostos para a estrutura forbol onde podese observar a perda de três moléculas de água levando a formação dos metabólitos detectados nas amostras tóxicas de folhas de J. curcas. 22

39 4.2. Caracterização do MIPCPESI A preparação do MIP envolve a formação de um complexo entre a molécula template e o monômero seguido da eliminação do template criando sítios seletivos na superfície do polímero (SALEHI, et al., 2016). Neste trabalho, foram utilizados aminopropil trietoxisilano como monômero, tetraetoxisiliano como agente reticulante e o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) foi usado como molécula molde para a síntese do MIP. A morfologia dos polímeros sintetizados foi verificada por análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV) na Figura 9 onde é possível observar a presença de macroporos na superfície dos polímeros. De acordo com a literatura, polímeros macroporosos são mecanicamente estáveis e preferíveis no preparo de polímeros molecularmente impressos (CORMACK & ELORZA, 2004). O MIP sintetizado apresenta maiores modificações em sua superfície tais como maior porosidade e cavidades impressas na Figura 9 (a) em comparação com o polímero não molecularmente impresso (NIP) na Figura 9 (b). Tais resultados estão de acordo com outros MIPs sintetizados como fase extratora (PEREIRA, et al., 2018; KRUPADAM, et al., 2010; ZHANG & HU, 2010). Figura 9. Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) do polímero molecularmente impresso (a) e polímero não molecularmente impresso (b) sintetizados. O forbol 12-miristato 13-acetato de fórmula molecular C 36 H 56 O 8 e massa foi utilizado como molécula molde na síntese do MIP. Para assegurar sua 23

40 remoção foram feitas análises do branco com MIPCPESI (+) MS em um espectrômetro de massas Ion Trap (IT) LCQ Fleet da Thermo Fischer Scientific. Na Figura 10 é apresentado o espectro de massas resultante no qual não foram detectados m/z referentes a moléculas do padrão PMA Abundância R e l a t i v a m/z A b u n d â n c i a r e l a t i v a m/z Figura 3. Espectro MIPCPESI (+) IT-MS branco no qual não foram detectados picos referentes aos ésteres de forbol. A capacidade extratora do MIP foi avaliada comparando as intensidades dos sinais obtidos para o PDA de m/z 449 e para os íons 12-deoxyforbol de m/z 347, 9,12-dideoxyforbol de m/z 329 e 4,9,12-trideoxiforbol de m/z 311 por análises MIPCPESI (+) MS e NIPCPESI (+) MS em extratos metanólicos preparados com 100 mg de folhas tóxicas de J. curcas. No gráfico de barras apresentado na Figura 11 é possível observar que o uso do MIP sintetizado proporcionou um aumento na intensidade dos picos referentes ao PDA de m/z 449 e dos íons deoxiforbóis de m/z 347, 329 e 311. Tais resultados indicam que as cavidades impressas formadas na superfície do MIP apresentam-se seletivas para moléculas de ésteres de forbol e são 24

41 promissoras para serem usadas para promover etapa de extração dos PEs diretamente da fonte de ionização Intensidade Absoluta MIPCPESI-MS NIPCPESI-MS 0 m/z 449 m/z 347 m/z 329 m/z 311 Figura 4. Gráfico de barras comparando as intensidades obtidas em espectro de massas para o forbol 12,13-diacetat de m/z 449 e para os íons deoxiforbóis de m/z 347, 329 e 311 em análises de extratos metanólicos de folhas tóxicas de J. curcas usando MIP e NIP acoplados com PESI (+) MS em modo Full scan. Barras de erro apresentam o desvio padrão das análises feitas em triplicata. Como observado, o forbol 12,13-diacetato de m/z 449 apresentou o maior aumento na intensidade de sinal obtido em análises com o método MIPCPESI em comparação com análises NIPCPESI. Tais resultados demonstram que adsorção do éster diterpenico PDA é maior do que a adsorção dos íons deoxiforbóis que contém apenas grupos hidroxilas, estes resultados eram esperados devido a maior similaridade estrutural do PDA com o PMA usado como molécula molde na síntese do MIP, uma vez que, a seletividade de um polímero molecularmente impresso é baseada na sua capacidade de interagir com moléculas do template ou moléculas com estrutura semelhantes às moléculas utilizadas como molde durante sua síntese (MURRAY & ÖRMECI, 2012; ANENE, et al., 2016; CAPRIOTTI, et al., 2010) Determinação de ésteres de forbol por MIPCPESI (+) MS Foram realizadas análises dos extratos metanólicos de J. curcas por MIPCPESI (+) - MS para verificação do desempenho da técnica na detecção dos 25

42 ésteres de forbol presentes nas amostras. A Figura 12 ilustra a comparação dos espectros obtidos por análises PESI-MS tradicional e MIPCPESI-MS. I n t e n s i d a d e C 20 H 24 O 4 [M + H] C 20H + 26 O [M + H] C 20 H 22 O 3 [M + H] MIP-PESI (+) - MS C 24 H 32 O 8 [M + H] PESI (+) - MS C 24 H 32 O 8 [M + H] m/z 500 Figura 5. Comparação entre espectros de extratos metanólicos de folhas tóxicas de J. curcas obtidos por MIPCPESI (+) MS e PESI (+) MS. Análises foram feitas no espectrômetro de massas Ion Trap LCQ Fleet em modo Full scan. O método MIPCPESI possibilitou a detecção do forbol 12,13-diacetato e dos íons deoxiforbóis diretamente dos extratos metanólicos sem o uso de etapas de prétratamento. Em análises com PESI-MS tradicional, o PDA é detectado com menor intensidade e os íons de m/z 347, 329 e 311 apresentam supressão iônica. A Figura 13 ilustra um comparativo entre as intensidades de vários íons detectados pelos dois métodos: MIPCPESI e PESI. Note que o uso do MIP, para promover etapa de extração direta, fornece as maiores magnitudes de sinais para os íons avaliados. O MIP promove um enriquecimento das moléculas alvo na camada polimérica, levando uma ionização eficiente por PESI e minimizando os efeitos de supressão iônica que são rotineiramente observados no PESI tradicional. 26

43 Figura 6. Gráfico de barras comparando as intensidades obtidas em espectro de massas para o PDA e para os íons 12-deoxiforbol de m/z 347, 9,12-dideoxiforbol de m/z 329 e 4,9,12-trideoxiforbol de m/z 311 em análises de folhas tóxicas de J. curcas usando MIPCPESI (+) - MS e PESI (+) MS tradicional em modo Full scan. Barras de erro apresentam o desvio padrão das análises feitas em triplicata. Como as análises de MIPCPESI-MS foram feitas em um LCQ-Fleet Ion Trap, e por se tratar de um equipamento de baixa resolução, foram feitos experimentos de fragmentação para confirmar a atribuição dos íons de m/z 449, 347, 329 e 311 aos ésteres diterpenos previamente identificados por análises em espectrômetro de massas de ultra alta resolução. A Figura 14 ilustra os espectros de fragmentação dos íons de m/z 449, 347, 329 e

44 (a) (c) (b) (d) Figura 7. Espectros MIPCPESI (+) MS/MS dos íons atribuídos ao forbol 12,13- diacetato (a), 12-deoxiforbol (b), 9,12-dideoxiforbol (c) e 4,9,12-trideoxiforbol (d). A atribuição da m/z 449 ao forbol 12,13-diacetato foi confirmada por experimentos MS/MS, nos quais observa-se um perfil de fragmentação característico que envolve perdas neutras de moléculas de água e de grupos acetato presentes em sua estrutura. A molécula de PDA possui vários sítios de ionização e, portanto, diversas rotas de fragmentação são possíveis. Na Figura 15 são apresentadas algumas possíveis rotas de fragmentação a partir da ionização de um dos grupos éster (a) e da ionização em um dos grupos hidroxilas (b). 28

45 (a) m/z 449 m/z H 2 O - H 2 O m/z 431 m/z H 2 O m/z 355 H O O O OH 29

46 (b) m/z 449 m/z m/z 315 m/z H 2 O Figura 8. Propostas de fragmentação para o íon forbol 12,13-diacetato de m/z 449 a partir da ionização em dos grupos éster (a) e ionização em um dos grupos hidroxila (b). Em experimentos CID, os íons 12-deoxiforbol, 4,12-dideoxiforbol e 4,9,12- trideoxiforbol apresentam perdas de neutras de moléculas de água (H 2 O, 18 Da). Reações de desidroxilação são comumente observadas nas estruturas de forbóis (GOEL, et al., 2007), como observado nos espectros de fragmentação destes íons, a eliminação de moléculas de H 2 O trazem estabilidade à estrutura e, consequentemente, maior abundância de sinal dos íons fragmentos [M + H] + - H 2 O. Para o íon m/z 347, além da eliminação de água, ocorre também a eliminação do grupo cetona (C=O, 28 Da), como proposto no mecanismo de fragmentação apresentado na Figura

47 - H 2 O m/z 347 m/z CO - CH 4 m/z 285 m/z 301 Figura 9. Mecanismos de fragmentação propostos para o íon 12-deoxiforbol, [C 20 H 26 O 5 + H] +, de m/z 347 Para o íon 4,12-dideoxiforbol de m/z 329 a eliminação de uma molécula de água leva a formação do íon fragmento de m/z 311, este íon também é comumente encontrado em amostras contendo ésteres de forbol, uma vez que é referente ao principal produto de degradação do núcleo forbol (VOGG, et al., 1999; BALDINI, et al., 2014). Em uma segunda rota de fragmentação, via um rearranjo [1,3] H, tem-se a eliminação neutra de um grupo HC COH (42 Da) e formação do íon fragmento de m/z 287. As rotas de fragmentação propostas a partir de dois diferentes sítios de ionização estão apresentadas na Figura

48 m/z 329 m/z H 2 O m/z 329 m/z C 2 H 2 O Figura 10. Mecanismos de fragmentação propostos para o íon 4,12-dideoxiforbol, [C 20 H 24 O 4 + H] +, de m/z 329 a partir da ionização em dois diferentes sítios de ionização. Em experimentos MS/MS do íon 4,19,12-trideoxiforbol de m/z 311 observa-se o típico padrão de fragmentação pela remoção de uma molécula de água e de um grupo cetona conforme reportado na literatura (BALDINI, et al., 2014; VOGG, et al., 1999; GOEL, et al., 2007). A Figura 18, ilustra a proposta de fragmentação para o íon de m/z 311 [C 20 H 22 O 3 + H] +, representada, respectivamente, pelas transições e m/z 311 m/z 293 m/z H 2 O - CO Figura 11. Proposta de fragmentação para o íon 4,9,12-trideoxiforbol, [C 20 H 22 O 3 + H] +, de m/z Desempenho analítico do método MIPCPESI-MS Uma curva analítica foi construída para quantificação do forbol 12,13- diacetato utilizando soluções da matriz branca, preparadas a partir de folhas de J. curcas não tóxicas, com adição do padrão PDA em concentrações de 1 a 30 µg.ml - 32

49 I n t e n s i d a d e 1. De acordo com a literatura, a concentração de ésteres de forbol em folhas de J. curcas é de aproximadamente 525 µg.g -1 (BALDINI, et al., 2014). Portanto, a faixa de trabalho variando de 1 a 30 µg.ml -1 foi escolhida para amostras preparadas a partir de 100 mg de folhas diluídas em 3 ml de metanol na qual alíquotas de 1 ml foram analisadas. A curva de calibração foi construída em modo SRM a partir do monitoramento das intensidades do íon fragmento mais intenso de m/z 391 em função da concentração do padrão PDA adicionado às amostras. Os espectros de fragmentação que mostram as transições em função da concentração utilizados na construção da curva analítica estão apresentados na Figura He ppm ppm ppm ppm ppm ppm ppm m/z Figura 19. Espectros de fragmentação obtidos em espectrômetro de massas Ion Trap LCQ Fleet da m/z 449 em diferentes concentrações por MIPCPESI (+) MS/MS em modo SRM

50 A linearidade do método proposto foi determinada pelo coeficiente de correlação da regressão linear das intensidades do íon fragmento m/z 391 versus as concentrações de padrão adicionadas às amostras. Na Figura 20 é apresentada a curva de calibração obtida com R 2 maior que 0,99. Figura 12. Curva analítica construída a partir das intensidades do íon fragmento m/z 391 com relação às concentrações de PDA adicionadas às amostras em espectros de massas MIPCPESI (+) MS/MS A precisão do método foi avaliada por meio da repetibilidade conforme descrito na Equação 1. A exatidão foi verificada pela relação percentual de recuperação do analito conforme Equação 2. As análises foram feitas em triplicata utilizando as concentrações baixa (5 ppm), média (15 ppm) e alta (25 ppm) contemplando o intervalo de linearidade. Para análises intra-dia, o menor valor de precisão foi de 7.72% para a amostra com concentração de 15 µg.ml -1 e o menor valor de exatidão foi de -1.60% para a amostra de 5 µg.ml -1. Para análises entre dias, os menores valores foram obtidos para a amostra de 25 µg.ml -1 sendo a precisão de 4.35% e exatidão de 5.65%. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 1 onde é possível observar precisão e exatidão com valores menores que 20% em concordância com o estabelecido no Manual de Garantia da Qualidade Analítica do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2015). Ademais, os resultados obtidos próximos de 15% estão de acordo com os valores de precisão e exatidão reportados na literatura para métodos que combinam polímeros molecularmente 34

51 impressos com técnicas de espectrometria de massas ambiente (PEREIRA, et al., 2018; FIGUEIREDO, et al., 2010). Tabela 1. Valores de precisão e exatidão obtidos para análises MIPCPESI para as concentrações de PDA de 5, 15 e 25 µg.ml -1 CN a (µg.ml -1 ) Intradia CA b (µg.ml -1 ) ± IE c (%) 4.92 ± ± ± 4.37 Precisão Exatidão CN a (µg.ml -1 ) Inter dias CA b (µg.ml -1 ) ± IE c (%) 5.65 ± ± ± 1.81 Precisão Exatidão a Concentração Nominal b Concentração Analisada c Incerteza Expandida (k = 2 para P = 95%) Para a determinação dos limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) foi calculado o desvio padrão de dez análises do branco. A Equação 3 e a Equação 4 foram utilizadas no calculo do LOD e LOQ, resultando, respectivamente, em valores de 0,28 µg.ml -1 e 0,92 µg.ml -1. Tais resultados na faixa de ppm estão de acordo com resultados reportados na literatura para determinação de ésteres de forbol em folhas e sementes de J. curcas via análises HPLC-MS/MS E HPLC-UV (BALDINI, et al., 2014; DEVAPPA, et al., 2013). Após avaliação do desempenho analítico do método, MIPCPESI foi empregado na determinação quantitativa do forbol 12,13-diacetato em extratos metanólicos de folhas de J. curcas. Os genótipos analisados foram cedidos pela Embrapa Agroenergia. Os resultados reportados na Tabela 2 mostram as concentrações de PDA determinadas nos genótipos tóxicos (113F, 199F e 259F) e não tóxicos (169F, 170F e 183F). A amostra 259F apresentou a maior concentração 35