Grupo de Pesquisa em Toxicologia Analítica

Transcrição

1 DESPROTEINIZAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE PELO SULFATO DE ZINCO ESTUDO E DESENVOLVIMENTO DE UMA NOVA ESTRATÉGIA. ElianiSpinelli(spinelli@vm.uff.br) 1 ; SoreleB. Fiaux 1 ; CassiaM. L. Silva 2 ; HelianeDuarte 1 1 Toxfree Universidade Federal Fluminense Niterói, RJ, Brasil. 2 Instituto Médico Legal do Rio de Janeiro, Brasil.

2 SOMOGYI, M. (1930) Sulfato de zinco a 10% e NaOH0,5 M O agente desproteinizanteseria seria o gel de hidróxido de zinco...

3 IYER& PRZYBYCIEN(1996) Mecanismo da precipitação de proteínas com metais divalentes: Histidina Triptofano Cisteína SH COO - 1ª etapa NH 2 M ++ H + M ++ M ++ H + H + M ++ H + M ++ N COO 2ª etapa ++ Reações cruzadas M M N S

4 IYER& PRZYBYCIEN(1996) Características da reação com metais divalentes: - Reação irreversível - A concentração de íons H + afeta a eficiência - A agitação pode gerar precipitado mais fino

5 Estratégias para o presente estudo: 1)Avaliação da eficiência da desproteinização através da dosagem de proteínas no sobrenadante obtido após centrifugação. 2) Investigação do efeito de variáveis através do planejamento experimental.

6 Dosagem de proteínas ZAIA et al. (1998) Revisão sobre as vantagens e desvantagens dos vários métodos de desproteinização. Método de Bradford : Rápido Sensível Execução simples Menos interferentes

7 Reagente de Bradford(1976) Brilliant Blue G, Sigma Aldrich(product number B0770-5G) Ácido fosfórico ACS86 86,3%,J.T.Baker Álcool etílico ACS96 96%,Vetec 0,9 Curva de calibração da albumina bovina Absorvância 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,007x + 0,051 R² = 0, Albumina (µg)

8 Esquema analítico Sobrenadante Precipitado Diluição com água destilada Alíquota para análise 10 µl a 100 µl Etc. Leitura da absorvância 1: 5 1: 10 1: 20 Reação com 5 ml do reagente de Bradford Curva de calibração µg de proteína µg/µl= (µg µgde proteína / µl de sobrenadante) x fator de diluição

9 Planejamento experimental Variáveis a serem investigadas Domínios Concentração do sulfato de zinco 0,5 10% Temperatura C Tempo 5 30 minutos A validade do modelo experimental foi determinada através da análise de uma amostra de sangue, em triplicata, nas melhores condições apontadas pelo modelo: comparação entre valor teórico esperado e valor obtido.

10 Gráfico de superfície, mostrando a dependência da concentração de proteína residual com a temperatura e a concentração de sulfato de zinco.

11 Melhores condições selecionadas pelo estudo: 0,5 ml sangue 1 ml sulfato de zinco a 1% Vortex por 10 s 45 C C / 15 minutos 3000 rpm/ 15 minutos Sobrenadante límpido Remoção de 99,3% das proteínas

12 Avaliação do efeito da desproteinização na recuperação da amitriptilina e nortriptilina Estratégia: comparação com a recuperação da extração direta, após seleção do solvente: - Hexano:acetato de etila 75:25 Resultado da 1ª avaliação: 20,2 % para amitriptilina 21,4 % para a nortriptilina Fármacos retidos no material precipitado?

13 WI:2 WI:4 WI:8 mvolts c:\star\data\sangue\exp 1 eter_ run File: Channel: Last recalc: c:\star\data\sangue\exp 1 eter_ run Front = FID Results NA Extração direta C 26 amitriptilina nortriptilina 0-20 mvolts Minutes Sangue fortificado com amitriptilina e nortriptilina a 2,5 µg/ml c:\star\data\sangue\sobrenadante2_ run File: Channel: Last recalc: c:\star\data\sangue\sobrenadante2_ run Front = FID Results NA C 26 amitriptilina nortriptilina Extração após desproteinização Minutes

14 Modificações efetuadas para aumentar o rendimento da extração Volume de água destilada? Diluição Antes ou depois do sulfato de zinco? Antes ou depois do aquecimento?

15 Volumes de precipitado obtidos na desproteinização de 1 ml de sangue. O sangue foi previamente diluído com quantidades crescentes de água (da direita para esquerda), antes da adição do sulfato de zinco. Diferença na compactação do precipitado obtido com a troca na ordem de entrada dos reagentes. Á direita, o sangue foi diluído antes da adição do sulfato de zinco. À esquerda, a diluição ocorreu após a adição do sulfato de zinco. Ambos os tubos foram centrifugados a 3000 rpm/ 15 min.

16 Melhor condição selecionada 1 ml de sangue 2 ml de sulfato de zinco a 1% Vortex / 10s 45 ºC / 15 minutos Diluição com 6 ml de água destilada Vortex / 20 s 3000 rpm por 15 min Separar o sobrenadante 1mL cloreto de amônia 3,3 N, ph ml hexano: acetato de etila 75: 25 Resultado da 2ª avaliação: 60 % para amitriptilina 85 % para a nortriptilina

17 Extração em fase sólida Bond Elut Certify 1. Condicionamento 2 ml de MeOH 2 ml tampão fosfato 0,1 M ph 6 Velocidade de eluição: 1 a 2 gotas / segundo 2. Aplicação do sobrenadante 1 a 2 gotas / segundo 3. Lavagem: cloreto de amônio 0,1 M ph 9,5 2 a 3 gotas / segundo 4. Secagem Vácuo : 20 Pol por 10 minutos 5. Eluição dos analitos 5 ml de Diclorometano: isopropanol:amônia 87:10:3 1 a 2 gotas / segundo

18 Resultado da 3ª avaliação: 80 % para amitriptilina 85 % para a nortriptilina 0,16 Curvas de calibração da nortriptilina 0,3 Curvas de calibração da amitriptilina Razão das áreas dos picos: analito / PE 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,072x -0,008 R² = 0,985 EFS y = 0,070x -0,007 R² = 0,985 Liq/Liq 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Razão das áreas dos piscos: analito / PE 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 0,133x + 0,002 R² = 0,987 EFS y = 0,123x -0,018 R² = 0,958 Liq/Liq 0 0,5 1 1,5 2 2,5 µg / ml µg / ml

19 OBRIGADA. Contato: