K P 10. Concentração. Potência a emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de excitação que é absorvido pelo sistema
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- João Vítor Brezinski Borja
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1 Concentração Potência a emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de excitação que é absorvido pelo sistema F = emissão de fluorescência P o = potência do feixe incidente P = potência após ter percorrido um comprimento b do meio K = constante que depende da eficiência quântica da fluorescência Lei de Beer P P 0 10 bc F K P 10 0(1 bc )
2 Concentração A expansão do termo exponencial resulta em uma Série de Maclaurin : F K P 0 [2,303 bc (2,303 bc) 2! 2 (2,303 bc) 3! 3...] ε.b.c = A < 0,05: 2,303 ε.b.c é muito maior que os outros termos: F K P 0[2,303 bc] P 0 constante F Kc
3 Concentração Soluções diluídas: fluorescência proporcional à concentração Desvios da linearidade: - 2,303εbc > 0,05: outros termos são significativos - auto-supressão - auto-absorção
4 Auto-supressão Auto-supressão Colisões entre moléculas excitadas Transferência de energia não radiativa com a concentração ocorrência de colisões
5 Auto-supressão Antraceno em diclorometano
6 Auto-absorção Auto-absorção de emissão se superpõe a um pico de absorção Fluorescência: emissão atravessa a solução e é reabsorvida por outras moléculas fluorescentes Antraceno em diclorometano
7 Supressão de fluorescência do inglês, Quenching efeito que diminui a intensidade de fluorescência o mecanismo pode envolver o estado excitado ou o fundamental do fluoróforo Supressão dinâmica Transferência de energia não radiativa da espécie excitada para outras moléculas Contato entre supressor e espécie excitada Supressão colisional Rendimento quântico e o tempo de vida
8 Supressão de fluorescência Supressão estática Formação de um complexo não fluorescente entre supressor e fluoróforo no estado fundamental Tempo de vida não é afetado
9 Espectros de excitação, fluorescência e fosforescência Fenantreno
10 Como medir a fluorescência? Instrumentação similar à UV-VIS Separar a radiação emitida daquela incidente utilizada para excitar a amostra Fluorescência ocorre em todas as direções, mas é melhor observada quando medida à 90 o em relação ao feixe incidente
11 Configuração típica
12 Configuração típica Transmite a radiação que excita a fluorescência, mas exclui ou limita a radiação do de emissão fluorescente.
13 Configuração típica Ângulo reto minimiza as contribuições do espalhamento e da radiação intensa da fonte. Transmite a radiação que excita a fluorescência, mas exclui ou limita a radiação do de emissão fluorescente. Isola a emissão da fluorescência
14 Componentes FONTES DE RADIAÇÃO: -lâmpadas de mercúrio (mais comum para fluorímetros), deutério, tungstênio e xenônio (para espectrofluorímetros) -diodos emissores de luz ( nm) -lasers SELETORES DE : -filtros de absorção ou interferência -monocromadores de rede CÉLULAS DE MEDIDA: -cilíndricas/retangulares -vidro/sílica/quartzo DETECTORES: -fotomultiplicadoras
15 Fluorímetro e espectrofluorímetro Espectrofluorímetro 2 monocromadores Fluorímetro apenas filtros
16 Aplicações Determinação de espécies inorgânicas direta: formação de complexo fluorescente supressão de fluorescência Determinação de espécies orgânicas produtos de plantas, esteróides, vitaminas Sensores ópticos para a determinação de metais pesados Reagente fluorescente sofre supressão na presença de metais pesados Sensor para oxigênio usando fibra-óptica Medidas de oxigênio parcialmente dissolvido
17 Exercício Um comprimido anti-malárico, contendo quinino, possui uma massa de 1,664 g, e foi dissolvido com HCl 0,10 mol L -1 em quantidade suficiente para fornecer 500 ml de solução. Uma alíquota de 20,00 ml foi então diluída para 100,0 ml com o ácido. A intensidade da fluorescência para a amostra diluída, em 347,5 nm, forneceu uma leitura de 245 em uma escala arbitrária. Uma solução-padrão de 100 ppm de quinino registrou o valor de 125, quando medida em idênticas condições. Calcule a massa em miligramas de quinino no comprimido original.
18 Fosforescência Fosforescência geralmente ocorre em um comprimento de onda maior que a fluorescência (E T < E S ) Diferença entre os comprimentos de onda dos dois processos é uma medida da diferença de energia entre os estados singlete e triplete Determinação de espécies bioquímicas como ácidos nucleicos, aminoácidos e enzimas Necessário medidas à baixas temperaturas Atualmente: pesquisas para medidas a temperatura ambiente
19 Quimiluminescência Reação química produz espécies em estados eletronicamente excitados, que emite luz ao retornar para o estado fundamental. Método altamente seletivo, simples e extremamente sensível. Reação: A + B C* + D C* C + hν onde C* representa o estado excitado da espécie C Quimiluminescência x Bioluminescência Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação é proveniente de uma reação química (ao invés da absorção de fótons, em fluorescência) Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência onde a reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo
20 Medida de quimiluminescência A instrumentação para medida de quimiluminescência é muito simples e pode consistir de somente um recipiente para a reação e um detector. Geralmente não é necessário um dispositivo para seleção de comprimentos de onda, uma vez que a única fonte de radiação é a reação química. Sinal obtido: Após a mistura de reagentes
21 Aplicações análise de gases
22 Aplicações espécies inorgânicas em fase líquida
23 Exercício Íons de ferro (II) catalisam a oxidação do luminol para H 2 O 2. A intensidade da quimiluminescência resultante aumenta linearmente com a concentração de ferro (II) entre e 10-8 mol L -1. Exatamente 1,00 ml de água foi adicionado a uma alíquota de 2,00 ml de uma solução de Fe(II) de concentração desconhecida, seguida pela adição de 2,00 ml de uma solução diluída de H 2 O 2 e 1,00 ml de uma solução alcalina de luminol. A quimiluminescência da mistura foi integrada durante um período de 10,0 s e apresentou o valor de 14,3. A uma segunda alíquota de 2,00 ml da amostra foi adicionado 1,00 ml de uma solução de Fe(II) 3,58x10-5 mol L -1, seguida pelo mesmo volume de H 2 O 2 e luminol. A intensidade integrada foi 33,3. Encontre a concentração de Fe(II) na amostra.
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