Imaging Mass Spectrometry. MSc. Elisângela Silva Doutoranda, área de Oncologia

Transcrição

1 Imaging Mass Spectrometry MSc. Elisângela Silva Doutoranda, área de Oncologia

2 Roteiro Princípios Aplicações Considerações experimentais Preparo da amostra Instrumentação Processamento dos dados Estratégias de Identificação protéica via ImageID Projeto de doutorado Outras técnicas de imageamento molecular Conclusões

3 Princípios MALDI Imaging ou Imaging Mass Spectrometry ou Imageamento molecular por espectrometria de massas Consiste numa ferramenta analítica que proporciona a aquisição de dados espectrométricos e distribuição espacial de bioanalitos diretamente de um tecido intacto. Gerando imagens moleculares. Análise de milhares de dados moleculares obtidos por m/z Alta especificidade e sensibilidade Fonte de ionização MALDI do inglês Matrix -Assisted Laser Desorption/ Ionization Analisador de massas TOF do inglês Time of flight

4 Princípios Overview Fonte: Angel & Capriole, 2013

5 Aquisição dos espectros de cada coordenada x,y Princípios 100% Um grid x, y é definido na superfície do tecido Intensity Fonte: Bruker Daltonics

6 Aplicações-MALDI Imaging e Câncer Busca de padrões moleculares com valor diagnóstico/ prognóstico e de resposta terapêutica

7 Aplicações Figura 4: Espectros médios dos grupos HER-2 positivo (n=15) e HER-2 negativo (n=15). B) Diferenças de expressão entre os grupos de câncer de mama. Fonte: Rauseer et al, 2010

8 Aplicações Figura 2: Classificação molecular de tecidos normais e tumorais. O TMA tripsinizado e submetido ao MALDI Imaging. Fonte: Angel & Capriole, foi

9 Aplicações Estudos metabólicos envolvendo drogas e farmacocinética. Identificação de biomarcadores de doenças. Detecção e quantificação de biomoléculas. Análise de proteínas, peptídeos, lipídeos e aminoácidos, incluindo massas intactas e modificações pós-translacionais Identificação de microorganismos como bactérias e fungos.

10 Aplicações Figura 1: Imagens moleculares de uma droga anti-câncer. a) Corte transversal sem coloração de um camundongo. b) Imagens moleculares do composto, alta concentração no tumor e baixa concentração no trato gastrointestinal e vasos sanguíneos. Fonte : Schwamborn & Caprioli, 2010.

11 Aplicações Figura 3: Imagens moleculares da distribuição de lipídeos em um coração de camundongo adulto. SM, sphingomyelin; PC, glycerophosphocholine. Fonte: Angel & Caprioli, 2013.

12 Aplicações Figura 5: Espectrograma de proteínas em rim de camundongo. Aplicação da matriz por sublimação. Fonte: Angel & Caprioli, 2013.

13 Aplicações Figura 6: Resposta sistemática à infecção pelo S. Aureus em ratos. Imagens esquerda, infectado e direita não infectado. Fonte: Attia et al., 2012.

14 Aplicações Figura 7: Identificação de metabólitos secundários, em folhas de tomate (Solanum habrochaites ). Fonte: Li et al., 2014.

15 Aplicações Figura 8: Localização espacial da hesperidina por MALDI MS/MS em plantas infectadas e não infectadas com a Xylella fastidiosa. Fonte: Soares et al., 2015.

16 Aplicações Fonte: Cillero-Pastor and Heeren, 2013

17 Aplicações Diversos centros especializados no mundo Tenddington, Reino Unido

18 Aplicações Diversos centros especializados no mundo Atlanta, Georgia, EUA

19 Aplicações Diversos centros especializados no mundo Göteborg, Suécia

20 Considerações experimentais SECCIONAMENTO APLICAÇÃO DA MATRIZ AQUISIÇÃO DOS ESPECTROS Workflow MALDI Imaging MOLECULAR IMAGES PROCESSAMENTO DADOS MALDI TOF/TOF

21 Preparo da amostras Fresh frozen ou parafinado? Botton up ou Topdown? Qual será o alvo? - Proteínas - Peptídeos - Lipídeos Espessura do corte > 8-12µm Lâminas ITO Considerações experimentais Pré- tratamentos e Diferentes tipos de matrizes

22 Preparo da amostras Resolução da imagem óptica Considerações experimentais Teaching points

23 Considerações experimentais Preparo da amostra Aplicação da Matriz Fonte: Bruker Daltonics

24 Considerações experimentais Preparo da amostra Aplicação da Matriz SUBLIMAÇÃO- ALTA RESOLUÇÃO!

25 Considerações experimentais Preparo da amostra Aplicação da Matriz Target Approuch -> hand spot Pipetar 1-3uL Matriz Pelo menos 2 camadas

26 Instrumentação Depende da sua pergunta!!! AutoFlexMALDI TOF TOF Considerações experimentais -Permite a análise de proteínas intactas. - Funciona melhor na faixa de pequenas proteínas e fragmentos. -Compostos < 500 Da ou > 25KDa raramente são detectados. - Modo reflexão - 3KDa faixa que contempla peptídeos e lipídeos. -Resolução sem sobreposição dos pixels -> 50um

27 Considerações experimentais Instrumentação - Maior resolução - Alto desempenho - Elevada precisão de massa -Diâmetros de foco de laser de até 10 µm para imagens com alta resolução espacial, sem sobreposição de pixels. Ultraflex MALDI TOF TOF

28 Considerações experimentais Instrumentação -Equipamento híbrido ESI MALDI FTMS - Alta Acurácia - Ideal para pequenas moléculas SOlariX

29 Considerações experimentais Instrumentação RapiFleX TM MALDI Tissuetyper TM -Delineado para imageamento -Pixel <10um -Sistema de espelhos permite uma rotação dupla do laser - Rápida aquisição! Aproxi. 50 pixel/segundo -Facilidade de limpeza da fonte

30 Considerações experimentais Processamento dos dados Subtração de background Normalizações -> minimizar ruído e variações causadas durante o preparo da amostra. Ferramentas de bioinformática Investigações clínicas- >Análises multivariadas, algoritmos genéticos classificatórios Softwares de análise de dados

31 Processamento dos dados Considerações experimentais

32 Processamento dos dados Considerações experimentais

33 Considerações experimentais Estratégias para Identificação de proteínas via ImageID Fonte: Modificado de Bruker Daltonics

34 Considerações experimentais Alternativa para Identificação de proteínas via ImageID

35 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MALDI Imaging- MS/MS Plano de Ação MS 400 LIFT 1166 m/z m/z m/z

36 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] MALDI Imaging- MS/MS Plano de Ação x MS KRT 5000 LIFT 1036 m/z I/L T m/z m/z

37 2) Padronização da tecnologia do MALDI Imaging Resultados Obtidos Figura 3: Imagens moleculares de proteínas detectadas em amostra de Carcinoma Peniano. Em 4319 m/z maior intensidade na região tumoral e em 4302 m/z, sinal mais intenso na região não tumoral. Sobreposição dos filtros da região tumoral (vermelho) e estroma (verde), discriminando as duas regiões no corte histológico. Resolução de 200µm.

38 Outras técnicas de Imageamento Molecular DESI Imaging, do inglês Desorption Electrospray Ionization Condições ambientais de temperatura e pressão

39 Outras técnicas de Imageamento Molecular Diversas aplicações Desvantagem-> Baixa resolução 150µm Limitações para detecção de peptídeos e proteínas Fonte: Wu et al. 2014

40 Outras técnicas de Imageamento Molecular Livia Eberlin, ex-aluna Unicamp, ganhou o Nobel Signature Award for Graduate Education in Chemistry- Melhor tese em química dos EUA. Aplicação do DESI Imaging em sala cirúrgica, durante a remoção de tumor cerebral.

41 Outras técnicas de Imageamento Molecular SIMS- do inglês Secondary Ion Mass Spectrometry Alta sensitividade para pequenas moléculas > 1ppm e resolução 200nm Composição de sólidos orgânicos e inorgânicos Extensivo dano na superfície da amostra Fonte: Wu et al. 2014

42 Conclusões O MALDI Imaging é uma técnica versátil e permite a visualização da distribuição espacial de bioanalitos. O tipo de instrumento utilizado dependerá do seu alvo. A aplicação da matriz é uma etapa chave da técnica, pois prejudicará a formação dos íons e dessorção. Já existem cerca de 30 novas técnicas de imageamento que usam a espectrometria de massas para gerar imagens moleculares. Fonte: Wu et al. 2014