Profª Eleonora Slide de aula. aminoácidos de cadeias polipeptídicas

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1 Determinação da seqüência de aminoácidos de cadeias polipeptídicas

2 Determinação da seqüência de aminoácidos de cadeias polipeptídicas 1ª Etapa: Determinação da composição em aminoácidos Hidrólise de todas as ligações peptídicas do polipeptídeo puro. A mistura obtida é analisada por cromatografia de troca iônica, para determinação dos aminoácidos presentes e das suas proporções relativas. 2ª Etapa: Identificação dos resíduos amino-terminal e carboxila-terminal. Resíduo Amino-terminal (utilizando 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno ou cloreto de dansil) 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno + peptídeo 2,4-dinitrofenil-peptídeo HCl 2,4-dinitrofenil-aminoácido (resíduo N-terminal) + aminoácidos livres NO2 2 F NO2 O resíduo de aminoácido N-terminal ligado ao 2,4-dinitrofenil é identificado por comparação cromatográfica com padrões de derivados dinitrofenilados dos diferentes aminoácidos. 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno

3 Cloreto de dansil + peptídeo dansil-peptídeo HCl dansil-aminoácido (resíduo N-terminal) + aminoácidos livres H 3 C CH 3 N O dansil-aminoácido é fortemente fluorescente. Pode ser detectado e dosado em concentrações muito menor que os dinitrofenil-aminoácidos. O S Cl O Cloreto de Dansil Resíduo Carboxila-terminal Utilizando a enzima carboxipeptidase que hidrolisa a ligação peptídica a partir da ponta carboxila-terminal da cadeia. Determinando qual aminoácido é liberado em primeiro lugar pela ação da carboxipeptidase, identifica-se o resíduo C-terminal no polipeptídeo.

4 3ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica (hidrólise seletiva) Tripsina - hidrolisa as ligações peptídicas das quais participa a carboxila de resíduos de arginina ou lisina. Um polipeptídeo com cinco resíduos de arginina e/ou lisina deverá produzir seis peptídeos menores. Com exceção de um, todos terão arginina ou lisina na posição C-terminal. Quimotripsina - hidrolisa as ligações peptídicas cujo grupo carboxila pertence a resíduos de fenilalanina, triptofano e tirosina. Mapa peptídico - Separação dos fragmentos produzidos por cromatografia de troca iônica em coluna, por eletroforese em papel ou por cromatografia em duas dimensões 2ª cromatografia origem 1ª eletroforese

5 4ª Etapa: Determinação da seqüência dos fragmentos peptídicos O método de degradação de Edman marca e remove apenas o resíduo N-terminal de peptídeos, deixando intacta todas as outras ligações peptídicas. Após a remoção e identificação do resíduo N-terminal, o novo resíduo N-terminal exposto pode ser marcado e removido pela repetição da mesma reação. Desta maneira, resíduo a resíduo, a degradação de Edman pode elucidar a seqüência inteira de aminoácidos de um peptídeo. Fenilisotiocianato + peptídeo OH feniltiocarbamoil-peptídeo HCl feniltiohidantoína (derivado do resíduo N-terminal) + peptídeo original (sem o resíduo N-terminal)

6 O resíduo de aminoácido N-terminal na feniltiohidantoína é identificado por cromatografia. Seqüências contendo até 20 aminoácidos podem ser facilmente identificadas. Permanece, entretanto, o problema de determinar como esses fragmentos são arranjados na cadeia polipeptídica original.

7 5ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica por um segundo método Brometo de Cianogênio - quebra apenas as ligações peptídicas nas quais o grupo carboxila pertence ao resíduo metionina. Assim, se o polipeptídeo contem 8 resíduos de metionina, a quebra com o brometo de cianogênio deverá produzir nove fragmentos peptídicos. Os fragmentos são separados por eletroforese ou cromatografia Temos agora dois grupos de fragmentos peptídicos, um obtido pela ação da tripsina e outro pela quebra química com o brometo de cianogênio. 6ª Etapa: Ordenação dos fragmentos peptídicos através da determinação de superposições A superposição de porções dos peptídeos obtidos na 2ª fragmentação indica a ordem correta dos peptídeos obtidos na 1ª fragmentação. Às vezes a 2ª quebra falha em estabelecer superposições para dois ou mais peptídeos da 1ª quebra. Neste caso, uma terceira ou mesmo quarta quebra por métodos diferentes deve ser utilizada.

8 Arranjo dos peptídeos em sua ordem correta, pelas sobreposições Exemplo: Resultados obtidos utilizando hidrólises seletivas com tripsina e quimotripsina. Resíduos terminais: N-terminal = Ser C-terminal = Gli Fragmentos da 1ª quebra (c/ tripsina): Ser-Asn-Tre-Trp-Arg Tyr-Cys-Arg Phe-Asp-Gli Leu-Ile-Lys Val-Lys Fragmentos da 2ª quebra (c/quimotripsina): Ser-Asn-Tre-Trp Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe Asp-Gli Arg-Val-Lys-Tyr 1º grupo de fragmentos Ser-Asn-Tre-Trp-Arg Val-Lys Tyr-Cys-Arg Leu-Ile-Lys Phe-Asp-Gli 2º grupo de fragmentos Ser-Asn-Tre-Trp Arg-Val-Lys-Tyr Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe Seqüência deduzida Asp-Gli Ser-Asn-Tre-Trp-Arg-Val-Lys-Tyr-Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe-Asp-Gli

9 Especificidade de alguns métodos importantes de fragmentação seletiva de cadeias polipeptídicas Tratamento Tripsina Quimotripsina Pepsina Termolisina Broneto de Cianogênio Ponto de quebra Lisina, Arginina (extremidade C-terminal) Fenilalanina, Triptofano, Tirosina (extremidade C-terminal) Fenilalanina, Triptofano, Tirosina e outros (extremidade N-terminal) Leucina, isoleucina, valina (extremidade N-terminal) Metionina (extremidade C-terminal)