Determinação da sequência de proteínas

Transcrição

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2 Determinação da sequência de proteínas Em 1953 Frederick Sanger sequenciou as duas cadeias da insulina. Os resultados de Sanger estabeleceram que todas as moleculas de uma determinada proteína têm a mesma sequência de aminoácidos. As proteinas podem ser sequenciadas de duas maneiras: - sequenciação real da cadeia polipeptidica - sequenciação do DNA do gene correspondente

3 A insulina consiste em duas cadeias polipeptídicas, A e B, unidas por duas ligações dissulfito. A cadeia A possui 21 residuos e a cadeia B possui 30 residuos. Sanger demorou 10 anos a completar a sequência Sequencia da insulina bovina.

4 Determinação da sequência de proteínas - uma estratégia em oito passos 1. Se possuir mais do que uma cadeia, separá-las. 2. Cortar (reduzir) as ligação dissulfito 3. Determinar a composição de cada cadeia 4. Determinar os resíduos no N- e C-terminais 5. Cortar cada cadeia em fragmentos menores e determinar a sequencia de cada fragmento 6. Repetir o passo 5., utilizando um método de fragmentação diferente de modo a gerar fragmentos diferentes 7. Reconsctruir a sequência da proteína a partir dos fragmentos 8. Determinar a posição das ligações dissulfito

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6 Passo 1 Separação das cadeias A interacção das subunidades depende de ligações fracas A separation pode ser executada com : - ph extremo - ureia 8M - guanidina HCl 6M - Elevadas concentrações salinas (normalmente com sulfato de amónio)

7 Passo 2 Quebra das ligações dissulfito Oxidação com ácido Performico Utilização de reagentes redutores de sulfidrilo - mercaptoetanol - dithiotreitol or dithioeritritol - de modo a prevenir a recombinação, tratar de seguida com um agente alkilante como o iodoacetato

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10 Passo 3 Determinação da composição em aminoácidos Estes resultados servirão para definir uma estratégia de fragmentação das cadeias polipeptídicas (passos 5, 6)

11 Passo 4 Identificação dos resíduos N- e C- terminais analise N-terminal : Reagente de Edman Fenilisotiocianato analise C-terminal : Análise enzimática (carboxipeptidase) A Carboxypeptidase A corta qualquer resíduo execepto Pro, Arg, and Lys A Carboxypeptidase B só corta Arg, and Lys

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13 Passos 5 e 6 Fragmentação das cadeias Fragmentação enzimática tripsina, quimotripsina, clostripaina, protease de staphylococcos fragmentação química Brometo de cianogenio

14 Fragmentação enzimática Tripsina corta no lado C- de residuos Lys e Arg Quimiotripsina no lado C de Phe, Tyr e Trp Clostripaina como a tripsina, mas ataca a Arg mais do que a Lys Protease de Staphylococcus Lado C- de Glu e Asp em tampão fosfato Especifica para a Glu em tampão acetato ou bicarbonato

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17 Fragmentação química Brometo de cianogénio CNBr actua só nos resíduos de metionina CNBr é util porque as proteínas possuem usualmente poucos residuos Met be able to recognize the results! a peptide with a C-terminal homoserine lactone

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20 Step 7: Reconstructing the Sequence Use two or more fragmentation agents in separate fragmentation experiments Sequence all the peptides produced (usually by Edman degradation) Compare and align overlapping peptide sequences to learn the sequence of the original polypeptide chain

21 Reconstructing the Sequence Compare cleavage by trypsin and staphylococcal protease on a typical peptide: Trypsin cleavage: A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K Staphylococcal protease: F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E

22 Reconstructing the Sequence The correct overlap of fragments: L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K Correct sequence: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K

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31 Laboratory Synthesis of Peptides Strategies are complex because of the need to control side chain reactions Blocking groups must be added and later removed du Vigneaud s synthesis of oxytocin in 1953 was a milestone Bruce Merrifield s solid phase method was even more significant

32 Solid Phase Synthesis Carboxy terminus of a nascent peptide is covalently anchored to an insoluble resin After each addition of a residue, the resin particles are collected by filtration Automation and computer control now permit synthesis of peptides of 30 residues or more

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37 Spectroscopic Properties All amino acids absorb in infrared region Only Phe, Tyr, and Trp absorb UV Absorbance at 280 nm is a good diagnostic device for amino acids NMR spectra are characteristic of each residue in a protein, and high resolution NMR measurements can be used to elucidate three-dimensional structures of proteins

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41 Separation of Amino Acids Mikhail Tswett, a Russian botanist, first separated colorful plant pigments by chromatography Many chromatographic methods exist for separation of amino acid mixtures Ion exchange chromatography High-performance liquid chromatography

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