PURIFICAÇÃO DO CITOCROMO b 5 UTILIZANDO SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS 1. OBJECTIVO

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1 PURIFICAÇÃO DO CITOCROMO b 5 UTILIZANDO SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS 1. OBJECTIVO Este trabalho experimental tem como objectivo a recuperação do Citocromo b 5 a partir de um extracto impuro por extracção líquido-líquido utilizando sistemas de duas fases aquosas (Fosfato / PEG). De forma a optimisar este processo de recuperação, serão realizados vários estudos ao nível do efeito do peso molecular do polímero, do efeito do comprimento da tieline e, por último, do efeito do ph na constante de partição, rendimento de extracção, factor de purificação e até mesmo selectividade do processo. 2. INTRODUÇÃO TEÓRICA Hoje em dia a Indústria requer processos económicos e rápidos no que diz respeito, entre outros, a processos de purificação de bimoléculas com elevados graus de pureza e rendimentos. Os processos de extracção líquido-líquido usando sistemas de duas fases aquosas são assim uma técnica onde os passos de clarificação, concentração e purificação parcial podem ser integrados em apenas um passo, sendo também bastante selectivos e fáceis de aumento de escala. Além das já referidas vantagens da utilização desta técnica na purificação de proteínas destaca-se o facto de ser um método que proporciona um ambiente óptimo para as biomoléculas, nomeadamente as proteínas, uma vez que ambas as fases são constituídas essencialmente por água (75-90%), e ainda a ausência de superfícies sólidas (como membranas ou outros suportes), evitando problemas de adsorção não-específica das proteínas a essas superfícies. Os sistemas de duas fases aquosas resultam da mistura de soluções aquosas de dois polímeros hidrofílicos tal como polietileno glicol e dextrano, ou de um polímero e de um sal como o fosfato de potássio, acima de determinadas concentrações críticas, de forma a que deixe de existir uma fase homogénea, ocorrendo a separação de fases. Estes sistemas podem assim ser representados por um diagrama de fases (Fig. 1). A linha curva que divide o diagrama em duas fases distintas designa-se de binodal. 1

2 Acima desta curva as misturas dão origem a duas fases em equilíbrio, enquanto que abaixo não há separação de fases resultando em soluções homogéneas. C % (p/p) Polímero P Binodal Uma fase Duas fases Tieline Fase de cima Fase de baixo % (p/p) Polímero ou Sal Figura 1. Diagrama de fases t ípico para um sistema de duas fases aquosas do tipo polímero/polímero ou polímero/sal (Adaptado de Kepka, 2004). A linha que une dois pontos sobre a binodal designa-se tieline e qualquer ponto P sobre esta linha resulta num sistema em que as fases de cima (C) e de baixo (B) têm as mesmas composições, variando apenas os volumes. O comprimento da tieline depende da concentração total do sistema, representando uma medida da diferença entre as fases de equilíbrio. Se o comprimento da tieline for diminuindo, o sistema aproxima-se do ponto crítico P, no qual as fases em equilíbrio têm iguais composições. A partição de proteínas neste tipo de sistemas é assim influenciada por factores como o peso molecular e o tipo de polímeros, a concentração de polímeros e de sal, o ph e a temperatura, bem como pelas caracteristicas da proteína que se pretende recuperar (peso molecular, ponto isoeléctrico e hidrofobicidade) (Albertsson, 1986). Tal como referido acima, o objectivo deste trabalho experimental é estudar o processo de recuperação de uma proteína recombinante, que consiste no domínio hidrofílico do Citocromo b 5 de rato, a partir de um extracto impuro. Esta proteína faz parte de um complexo enzimático que catalisa a insaturação de ácidos gordos 2

3 (Sarmento, 1994) e foi clonada em Escherichia coli (TB1) apresentando um peso molecular de Da e um ponto isoeléctrico de 4.4 (Sarmento, 1994; von Bodman, 1986). 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1 Preparação dos sistemas de duas fases aquosas Na Tabela 1 estão apresentadas as concentrações de fosfato de potássio (K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 ) a ph 7.5 e de PEG de diferentes pesos moleculares correspondentes a várias tielines cujas composições foram obtidas a partir dos respectivos diagramas de fases (Albertsson, 1986). Tabela 1. Composição das tielines para o PEG de diferentes pesos moleculares. % (p/p) Fosfato de potássio / % (p/p) PEG Tipo de Polímero Tieline 1 Tieline 2 Tieline 3 Tieline 4 PEG / PEG / / / / 17.8 PEG / PEG / Para a realização do estudo dos diversos efeitos (peso molecular, comprimento da tieline e ph) é necessário prepararem-se sistemas de duas fases aquosas que podem ser obtidos juntando as quantidades necessárias dos diferentes componentes de acordo com as Tabelas 2, 3 e 4. 3

4 Tabela 2. Componentes a adicionar para obter os sistemas de duas fases aquosas correspondentes à tieline 2 preparados a partir de PEGs de diferentes pesos moleculares (para uma massa total de sistema de 6 g). Efeito do peso molecular do PEG 40% Fosfato 50% PEG Água Extracto (K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 ) Impuro ph 7.5 Fosfato / PEG Fosfato / PEG Fosfato / PEG Fosfato / PEG Tabela 3. Componentes a adicionar para obter os sistemas de duas fases aquosas correspondentes às diferentes tielines preparados a partir do PEG 1000 (para uma massa total de sistema de 6 g). Efeito do comprimento da Tieline 40% Fosfato 50% PEG 1000 Água Extracto (K 2 HPO 4 + KH 2 PO 4 ) Impuro ph 7.5 Tieline Tieline Tieline Tieline Tabela 4. Componentes a adicionar para obter os sistemas de duas fases aquosas correspondente à tieline 4 preparados a partir do PEG 1000 e de fosfato de potássio a diferentes valores de ph (para uma massa total de sistema de 6 g). Efeito do ph 40% Fosfato (K 2 HPO 4 50% PEG 1000 Extracto Impuro + KH 2 PO 4 ) ph ph ph ph

5 Introduzir em cada tubo uma dada quantidade de solução stock de fosfato de potássio ao ph desejado (que consiste numa mistura de fosfato de potássio monobásico e dibásico de forma a obter o valor de ph pretendido) e adicionar a quantidade apropriada de solução stock de PEG de peso molecular desejado. Em seguida adicionar a água necessária e após agitação em vortex adicionar o extracto impuro. Após nova agitação em vortex, separar as fases por centrifugação a 3000 rpm durante 10 min. Medir o volume de ambas as fases e separá-las de forma a se poder dosear o citocromo b 5 e a proteína total. Preparar também brancos aos quais se adiciona água em vez de extracto impuro, de forma a eliminar as interferências do PEG e do fosfato nos métodos de dosagem das proteínas. 3.2 Quantificação do Citocromo b 5 Na sua forma oxidada, o Citocromo b 5, apresenta uma banda de Soret a 411 nm com um coeficiente de extinção molar de 130 mm -1 cm -1 (von Bodman, 1986). Sendo assim, a concentração de Citocromo b 5 nas fases de cima (fase rica em PEG) e de baixo (fase rica em fosfato) é determinada por leitura da absorvância a 411 nm contra um branco constituído pelas fases de cima e de baixo, respectivamente. As amostras de ambas as fases devem ser diluídas 1:2 e o extracto bruto diluído 1: Quantificação da Proteína Total A concentração de proteína total em cada fase do sistema será determinada pelo método de Bradford (Bradford,1976). Este método envolve a ligação das proteínas ao corante Coomassie Brilliant Blue G-250, formando um complexo que absorve a 595 nm. Esta reacção é rápida e completa-se em cerca de 2 min mantendo-se a cor praticamente inalterada durante 1 h. Visto que, o complexo formado possui um coeficiente de extinção elevado este método possui uma elevada sensibilidade. Além disso, este método de doseamento de proteínas não está também sujeito a um grande número de interferências, sendo estas apenas relevantes na presença de tampões fortemente alcalinos e de elevadas concentrações de detergentes. 5

6 De forma a quantificar a proteína total em ambas as fases, adiciona-se 300 ul de amostra de cada fase a 3000 ml de reagente de Bradford e agita-se num vortex. Em seguida lê-se a absorvância a 595 nm contra um branco constituído pelas fases de cima e de baixo sujeito ao mesmo tratamento. As amostras de ambas as fases devem ser diluídas 1:5 e o extracto bruto diluído 1:15. Preparação do Reagente de Bradford Dissolver 100 mg de azul de Coomassie em 50 ml de etanol a 95% e adicionar posteriormente 100 ml de ácido ortofosfórico a 85%. Por fim, diluir até perfazer o volume de 1 L e filtrar. 4. RESULTADOS EXPERIMENTAIS Efeito do peso molecular do PEG V Fc V Fb Cit. Fc Cit. Fb Prot. Fc Prot. Fb Fosfato / PEG 400 Fosfato / PEG 1000 Fosfato / PEG 3350 Fosfato / PEG 8000 Efeito do comprimento da Tieline V Fc V Fb Cit. Fc Cit. Fb Prot. Fc Prot. Fb Tieline 1 Tieline 2 Tieline 3 Tieline 4 6

7 Efeito do ph V Fc V Fb Cit. Fc Cit. Fb Prot. Fc Prot. Fb ph 6.7 ph 7.5 ph 8.5 ph 9.5 Nota: Fc Fase de cima; Fb Fase de baixo. 5. TRATAMENTO DE RESULTADOS Para cada sistema calcular: - os coeficientes de partição do citocromo b 5 e da proteína total; - o rendimento de extracção para o citocromo b 5 e para a proteína total; - o factor de purificação do citocromo b 5 ; - a selectividade. 6. BIBLIOGRAFIA Albertsson, P.A., Partition of Cell Particles and Macromolecules, 3ª ed., John Wiley & Sons, NY, 1986; Bradford, M.M., A rapid sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding, Anal. Biochem., 72 (1976), ; Kepka, C., Integration of Aqueous Two-Phase Systems into Recovery Processes for Biomolecules, Lund University, Sweden, 2004; Sarmento, M.J., Extracção Líquido-Líquido de uma Proteína Recombinante, Citocromo b 5, utilizando s de Duas Fases Aquosas, IST/UTL, 1994; Von Bodman, S.B., Schuller, M.A., Jollie, D.R. and Sligar, S.G., Synthesis, bacterial expression and mutagenesis of the gene coding for mammalian cytochrome b 5, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83 (1986),