FISIOLOGIA ANIMAL II

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1 DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA FISIOLOGIA ANIMAL II AULA 1 DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DE ENZIMAS DIGESTIVAS ARMANDO CRISTÓVÃO, PAULO SANTOS

2 Parte A Determinação da actividade das amilases O amido é um polissacarídeo de glicose que pode existir em duas formas: α-amilose e amilopectina. A α-amilose é o polímero linear em que os monómeros de glicose estão unidos por ligações glicosídicas α-1,4. A amilopectina é um polissacarídeo ramificado, em que as ligações lineares das cadeias são do tipo α-1,4 e as ligações das ramificações, que ocorrem de 12 em 12 sub-unidades, são do tipo α-1,6. AMILOSE AMILOPECTINA As enzimas envolvidas na digestão destes polímeros são as amilases, que existem em diferentes formas. A α-amilase, existente na saliva, hidroliza as ligações α-c1-o-c4 ao acaso, produzindo α-maltose, maltotriose e α-dextrinas. Esta enzima passa as ligações α-1,6 das ramificações da amilopectina. A β-amilase remove unidades de maltose de uma forma alternada dos terminais não redutores do amido. Os seus produtos são a β-maltose e β-dextrinas, não produzindo praticamente nenhuma glicose. Esta enzima não consegue ultrapassar as ramificações α-1,6. Se na amilose existir um número ímpar de resíduos de glicose, é libertado uma maltotriose que mais tarde é lentamente convertida em maltose e glucose. As cadeias lineares de α-amilose são completamente convertidas. 2

3 etapas: O método de determinação da actividade das amilases desenrola-se em diferentes 1. Reacção enzimática Amido amilase amido + maltose 2. Redução da maltose A maltose com o seu poder redutor, reage com Cu 2+ do regente de Shaffer a Somogyi (SS), que por sua vez vai reduzir o iodo presente neste reagente. Amido + maltose + I 2 (Amido + I 2 ) + 2I - 3. Quantificação do iodo não reduzido Para evitar a reoxidação do iodo adiciona-se H 2 SO 4 que vai acidificar a solução. O iodo não reduzido liga-se às cadeias de amido conferindo-lhe uma tonalidade azul-violeta. O iodo não reduzido é quantificado por titulação com tiosulfato de sódio, sendo desta forma retirado da cadeia de amido (Amido + I 2 ) + S 2 O 3 2- (Amido) + S 4 O I - AZUL INCOLOR PARTE EXPERIMENTAL 1. Soluções: Amido solução a 1 % (p/v) em água Maltose solução a 0,1 % (p/v) em água H 2 SO 4 2,5 M Na 2 S 2 O 3 25 mm + 3,33 mm NaOH Tampão fosfato 50 mm fosfato ph 6,9 + 1 mm CaCI 2 50 mm fosfato ph 4,9 + 1 mm CaCI mm -mercaptoetanol Reagente SS Fosfatodissódico anidro (Na 2 HPO 4 ) 28g, tartarato sódico-potássico 40g, hidróxido de sódio (NaOH) 4g, sulfato de cobre (CuSO 4 ) 8g, sulfato de sódio (Na 2 SO 4 ) 180g, iodeto de potássio (KI) 25 mg, iodato de potássio (KIO 3 ) 2,14g. 2- Octanol 3

4 2. Isolamento das amilases 2.1. Isolamento de a-amilase 1. Recolher 3 ml de saliva a colectar na presença de 1 gota de 2-octanol. 2. Diluir para 30 ml com tampão fosfato a ph 6,9. 3. Centrifugar a 3000 x g, durante 10 minutos, a 4 C. 4. Utilizar o sobrenadante Isolamento de b-amilase 1. Arranjar 10 g de batata doce e homogeneizar (utilizar um copo para batidos) em 100 ml de tampão fosfato a ph 4,9. 2. Filtrar o homogeneizado num pano de algodão ou linho. 3. Centrifugar a 3000 x g, durante minutos, a 4 C. 4. Utilizar o sobrenadante. 3. Determinação da actividade da b-amilase e da de a-amilase Nota importante: As condições experimentais aqui referidas dependem da actividade da preparação enzimática utilizada. Diversos ajustes poderão ser levados a cabo no protocolo de acordo com a alteração destes parâmetros Construção da curva padrão 1. Prepare os tubos indicados na tabela I 2. Misture muito bem as amostras em vórtex Tabela I Tubo Água Amido Maltose Reagente SS 1 4,5 0,5 0 5 Maltose (mg) Volume Na 2 S 2 O 3 Vol. Tubo 1 Vol. Tubo 2 3,5 0, ,5 0, ,5 4,5 5 A B 4

5 3. Coloque o suporte num banho com água em ebulição durante 15 minutos 4. Retire a deixe arrefecer (coloque em gelo para uma maior rapidez) 5. Adicione 1 ml de H 2 SO 4 6. Titule com Na 2 S 2 O 3 25 mm e registe os volumes utilizados 3.2. Ensaio enzimático 1. Marcar 2 tubos (A e B) e adicionar: 0,5 ml de amido em ambos 0,5 ml de α-amilase ao tubo A 0,5 ml de β-amilase ao tubo B 2. Incube precisamente 3 minutos à temperatura ambiente 3. Adicione 5 ml de reagente SS seguido de 4 ml de água 4. Misture muito bem as amostras 5. Coloque o suporte num banho com água em ebulição durante 15 minutos 6. Retire, deixe arrefecer e coloque em gelo 7. Adicione 1 ml de H 2 SO 4 8. Titule com Na 2 S 2 O 3 25 mm e registe os valores necessários 4. Cálculos Com os valores obtidos com os padrões faça o gráfico em que relaciona a quantidade de maltose versus o volume utilizado a titular (diferença entre o volume utilizado na titulação do branco, tubo 1 e de um outro tubo) Expressar a actividade das amilase em unidades ( uma unidade liberta 1 mg de maltose /3 min) e em µmol/min (o peso molecular da maltose é 342,31 g). 5

6 Parte B Determinação da actividade das lipases pancreáticas Os triglicerídeos, moléculas compostas por uma molécula de glicerol e três ácidos gordos (Fig. 1), são digeridos pelas lipases pancreáticas, originando ácidos gordos livres e glicerol ou 2- monoacilglicerídeo (Fig. 1). Ácidos gordos Triglicerídeo 2-monoglicerídeo Fig. 1- Acção enzimática de lipases sobre um triglicerídeo. Os triglicerídeos encontram-se em gotículas, que são insolúveis em água, enquanto que a lipase pancrática é solúvel em água. Por este facto a lipase actua apenas à superfície das gotículas lipídicas. Desta forma a velocidade de digestão vai depender da área que está acessível à acção da lipase. Esta área é aumentada por emulsificação (Fig. 3), que requer uma acção mecânica para formar gotas mais pequenas, a um agente emulsificante (ácido glicocólico, Fig. 2) que evita que as gotas de se reagruparem. Ác. deoxicólico Ác. glicocólico Lado apolar Lado polar Fig. 2- Estrutura do ácido glicocólico (centro), e do análogo sintético ácido deoxicólico (esquerda). À direita encontra-se uma representação tridimensional do ácido glicocólico, evidenciando as partes polares (a escuro). 6

7 Fig. 3- Processo de emulsificação Na digestão dos triglicerídeos há produção de ácidos gordos que levam a uma acidificação do meio, que pode ser seguida utilizando um eléctrodo de ph (chama-se a esta técnica protonometria). Nestas experiências pretende-se visualizar a acção dos sais biliares na digestão dos triglicerídeos. PARTE EXPERIMENTAL 1. Soluções Na 2 CO 3 solução a 0,5 % (p/v) em água Leite gordo Deoxicolato de sódio (DOC)10 % (p/v) em água Pancreatina 2,5% (p/v) em Na 2 CO 3 0,5% (Note bem: a pancreatina é um extracto de enzimas do pâncreas) Nota importante: As condições experimentais aqui referidas dependem da actividade da preparação enzimática utilizada. Diversos ajustes poderão ser levados a cabo no protocolo de acordo com a alteração destes parâmetros. 2. Determinação da actividade das lipases 2.1. Calibração do eléctrodo 1. Acerte a temperatura para o valor existente na sala 2. Entre a utilização de duas soluções diferentes o sistema deverá ser bem lavado a seco encostando o eléctrodo a papel absorvente 3. Coloque o eléctrodo no padrão ph 7 e ajuste o valor com o botão CAL 4. Coloque o eléctrodo no padrão ph 4 e ajuste o valor com o botão slope. Na ausência deste botão utilize o botão que regula a temperatura 7

8 2.2. Experiência 1 1. Ajuste o registador de forma a efectuar um registo com uma velocidade de 2 cm/min, a uma sensibilidade de 200 mv. (Isto é válido para todas as experiências) 2. Adicione 3 ml de leite 3. Adicione 1 ml de pancreatina 2,5% 4. Espere aproximadamente 2 min.(anote o valor de ph a que inicia a experiência, que deverá ser próximo de 8, pois deverá começar a experiência 2 ao mesmo valor de ph). 5. Ajuste o valor no registador a efectue o registo durante aproximadamente 3 min. 6. No final lave muito bem a câmara 2.3. Experiência 2 1. Adicione 3 ml de leite 2. Adicione 100 µl de DOC 10%. 3. Adicione 1 ml de pancreatina 2,5% 4. Espere aproximadamente 2 min (inicie a experiência ao mesmo valor de ph em que iniciou a experiência 1) 5. Ajuste o valor no registador a efectue o registo durante aproximadamente 3 min 6. No final lave muito bem a câmara 2.4. Experiência 3 1. Adicione 3 ml de leite 2. Adicione 1 ml de Na 2 CO 3 0,5% 3. Espere aproximadamente 2 min 4. Ajuste o valor no registador a efectue o registo durante aproximadamente 3 min 5. No final lave muito bem a câmara a como não efectua mais experiências coloque um pouco de tampão na câmara de reacção 3. Resultados Calcule a acidificação observada em cada experiência (pode expressar em unidades arbitrárias /min). Experiência 1: Experiência 2: Experiência 3: Como explica as diferenças entre a experiência 1 e 2? Porque começou a experiência 1 e 2 ao mesmo valor de ph? Para que efectua a experiência 3? 8

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