Universidade Estadual Paulista UNESP Instituto de Biociências de Botucatu IBB Bioquímica Vegetal

Transcrição

1 Campus de Botucatu Universidade Estadual Paulista UNESP Instituto de Biociências de Botucatu IBB Bioquímica Vegetal ROTEIRO PARA RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA EM LABORATÓRIO: DETERMINAÇÃO DA PROTEÍNA SOLÚVEL Profa. Dra. Giuseppina Pace Pereira Lima Colaboração: Richardson Barbosa Gomes da Silva Engenharia Florestal Botucatu SP Junho 2007

2 Introdução Nesta aula prática aprenderemos que a proteína total é formada pela proteína solúvel e pelas proteínas ligadas (à membrana, parede celular e etc.). Na ocasião, focaremos o interesse da aula na determinação da proteína solúvel referente a uma amostra de material vegetal distribuída aleatoriamente aos grupos. Para isso, utilizaremos o método de Bradford (1976) que utiliza o corante "Coomassie brilliant blue", o BG-250. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No ph de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. O Método de Bradford é vantajoso por ser simples e rápido, além de que, não permite que compostos fenólicos interfiram na medida das proteínas. Reativos Usados: - Reativo de Bradford mg de Coomassie brilliant blue. - Etanol. - H 3 PO 4. Desenvolvimento Curva de Referência 100 mg de caseína (Merck) diluída em 100 ml de água = (solução). Primeiro colocar a caseína (pó) em NaOH fraco e aquecer levemente. Só após estar totalmente diluída a solução, completar com água destilada. Portanto 1 mg = 1 ml

3 Material : - 6 tubos numerados Sendo : 10 ml de água 2 ml de solução + 8 ml de água 4 ml de solução + 6 ml de água 6 ml de solução + 4 ml de água 8 ml de solução + 2 ml de água 10 ml de solução = somente caseína Método : - Retira-se 0,1 ml de cada tubo, começando do tubo que contém água. O ideal seria lavar a pipeta todas as vezes que mudar de tubo e enxugar a sua ponta para evitar contaminações e conseqüente alteração na concentração. - A esta alíquota retirada adiciona-se 5 ml do reativo de Bradford, seguida pela homogeneização da solução e então será levada ao espectrofotômetro para leitura à 595 nm.

4 Em relação à amostra: - Pesa-se a amostra vegetal distribuída, macerada em nitrogênio líquido e em seguida coloque-a em um cadinho. - Adicione 5 ml de tampão fosfato 0,2 M ph 6,7. - O material macerado é então colocado na centrífuga por 10 minutos a 3000 rpm. - Forma-se 2 fases: - o sobrenadante (em cima) e o precipitado (em baixo). - Retira-se 0,1 ml do sobrenadante e a esta alíquota soma-se mais 5 ml do reativo de Bradford, agite para homogeneizar e deixe em repouso por 15 minutos. - Feito isso efetua-se a leitura no espectrofotômetro á 595 nm. - O branco é elaborado com 0,1 ml de tampão com 5 ml de reativo de Bradford, homogeneíze e deixe em repouso por 15 minutos, para após estas etapas ler no espectrofotômetro à 595 nm. O branco tem a função de zerar o aparelho. - Quanto mais azul a amostra ficar, maior concentração de proteína a amostra possui, isso será verificado nos Resultados onde apresentarmos os cálculos e a representação gráfica por meio da curva padrão. Resultados: Exemplo: Montando a Tabela: 100 mg ml 0,1 mg = 0,1 ml = 100 ug Tabela X (ug) Y (Abs) Tubos [ ] de Proteína Leitura , , , , ,519

5 0,6 0,55 0,5 y = 0,005025x + 0, R 2 = 0, ,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Cálculos: A) Através da Equação da Reta: y = 0, x + 0,0377 A Leitura da amostra vegetal distribuída para o grupo foi de 0,085 Abs. E a massa pesada na balança foi de 0,3315 g; Portanto, substituindo a leitura da amostra (0,085) na equação, vem: X = (0,085 0,0377) = 9,41 ug 0, Então, se: 9,41 ug 0,1 ml Z 5,0 ml Z = 470,5 ug em 5,0 ml

6 Lembramos então que: 470,5 ug 0,3315 g (peso da amostra) W 1 g W = 1419,31 ug proteína/ grama matéria fresca ou 1,41931 mg proteína/ grama matéria fresca B) Através do Gráfico: Colocando a Leitura da amostra vegetal (0,085) no gráfico (eixo y), rebatese a medida para o eixo x. Como no exemplo abaixo: 0,6 0,55 0,5 y = 0,005025x + 0, R 2 = 0, ,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,085 0,1 0, O número aproximado obtido através do gráfico é 9. Portanto procedemos assim: 9 ug 0,1 ml x 5 ml x = 450 ug E, 450 ug 0,3315 g y 1 g y = 1357,47 ug proteína / grama matéria fresca ou y = 1,35747 mg proteína / grama matéria fresca

7 Comparando, os dois métodos, tanto o cálculo feito através da equação da reta como o do gráfico, os resultados devem ser os mais próximos possíveis. No entanto, pequenas diferenças entre os dois métodos são aceitas. Pelo fato do método do gráfico se valer de estimativas que levam à imprecisão. Como elaborar o relatório da aula prática: Capa nome e curso Introdução Comentando o método usado, incluindo o objetivo da aula. Material e Métodos Descrever todos os materiais e métodos usados, incluindo vidraria. Descrever como foi elaborada a sua medição, no caso de proteínas totais solúveis. Descrever os passos detalhadamente. Resultados Descrever os seus resultados, inserindo gráficos e tabelas (numerando-os e inserindo as legendas). Discutir os resultados. Conclusão Referências Bibliográficas usadas para o relatório, nas normas da ABNT. BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the qualification of microgram quantities of protein utlizy the principle of protein dye binding. Anal. Biochem., v.7, p