Detecção de proteínas. Proteínas são heteropolímeros de aminoácidos unidos por ligações peptídicas

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1 Detecção de proteínas Proteínas são heteropolímeros de aminoácidos unidos por ligações peptídicas

2 A detecção e quantificação de uma proteína através de espectrofotometria se baseia nas propriedades de absorção de luz: 1) da ligação peptídica; 2) de grupos presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos que a constituem; 3) de produtos coloridos resultantes de reações entre a proteína e compostos químicos específicos.

3 Método princípio interferentes observação Biureto Complexo entre Cu +2 e ligação peptídica absorve em 540nm Sulfato de amônio, lipídeos, amido, lactose, aminoácidos livres (His, Ser, Thr) Baixa sensibilidade (mg) Bradford Complexo entre o corante Comassie Blue G-250 e cadeias laterais de Lys, Arg, Tyr, e Trp absorve em 595 nm Uréia (> 45g/L), detergentes (Triton X-100 e SDS) e lipídeos Boa sensibilidade (µg) Rápida execução (min) Absorbância UV Cadeias laterais de Trp, Phe e Tyr aborvem em 280nm Aminoácidos livres (Trp, Phe e Tyr) Boa sensibilidade (µg) Rápida execução (min) É preciso conhecer a composição de aminoácidos da proteína para calcular ε (coeficiente de extinção molar) Ideal para proteínas purificadas Referência: Zaia et al., Química Nova 21(6),

4 Complexo Cu +2 -ligação peptídica Comassie Blue G-250

5 Estratégia para dosagem de proteínas no lisado das células de levedura Proteínas + Corante (CBG) Complexo Colorido Como correlacionar a cor formada com a quantidade de proteína presente?

6 log I/I 0 = -α c l log I/I 0 = - absorbância absorbância = α c l absorbância = cte. c y = inclinação. c Abs. concentração massas mols

7 Experimentalmente Abs. concentração massas mols

8 Experimentalmente Abs. concentração massas mols

9 Equação da reta (y = ax + b; neste caso Abs = inc. massa +b) Limites inferior e superior de absorbância possibilidade de fuga da linearidade Abs. concentração massas mols

10 Curva padrão para dosagem de proteínas com Reagente de Bradford (Comassie Blue G) Diferentes massas de proteína Corante Absorbância (595 nm) Abs 595nm massa de proteína (mg)

11 Tabela 1 tubos albumina água reagente de 0,2 g/l (µl) (µl) Bradford (ml) branco , , , , , , , , ,0 Tabela 3 tubos L100X (µl) H 2 O (µl) reagente de Bradford (ml) branco ,0 A ,0 A ,0 A ,0 A ,0 tubos A 595 A1 A2 A3 A4 [proteína] (mg/ml)

12 Enzimas são catalisadores biológicos. -especificidade em relação aos produtos e reagentes E + S k E + P A presença de uma enzima específica pode ser detectada através da ocorrência da reação (formação do produto)

13 Como quantificar a enzima? E + S k E + P v = k [E] [S] Assim, a velocidade é diretamente proporcional a concentração de enzima e de substrato

14 v = k [E] [S] v [P] tempo

15 inclinação = v = [P]/ t v [P] Qual v usar? tempo

16 v = k [E] [S] Assim, se [S] ~ constante (igual à inicial), a velocidade é diretamente proporcional a concentração de enzima [P] Se menos de 10 % for consumido, podemos assumir v ~ constante. (v inicial; v 0 ). tempo

17 Medida de velocidade inicial Se a velocidade inicial é constante, então para determiná-la é preciso construir uma curva de [P] x tempo e verificar se é linear. [P] A velocidade inicial (v 0 ) é proporcional à concentração de enzima vários tempos tempo

18 v = k [E] [S] [P] tempo - esgotamento do substrato - inativação da enzima

19 Medida de velocidade inicial [P] vários tempos x 1 único tempo tempo

20 Medida de velocidade inicial [P] vários tempos x 1 único tempo tempo

21 Medida de velocidade inicial [P] vários tempos x 1 único tempo tempo

22 [P] tempo 1 U de atividade = quantidade de E em uma reação com velocidade de formação de 1 µmol de Produto / min 1 U = 1 µmol P / min

23 CH 2 OH O CH 2 OH O O maltose H 2 O α-glicosidase ou maltase CH 2 OH O CH 2 OH O

24 CH 2 OH O CH 2 OH O O CH 2 OH maltose O O NO 2 p-nitrofenil-α-glucosídeo

25 CH 2 OH O O NO 2 p-nitrofenil α glucosídeo CH 2 OH O + α-glicosidase ph 7,0 HO NO 2

26 CH 2 OH O O NO 2 p-nitrofenil α glucosídeo CH 2 OH O + α-glicosidase ph 7,0 HO NO 2 ph 11,0 H O (p-nitrofenolato; amarelo)

27 Preparar este conjunto de tubos para as três diluições do lisado (10x, 50x e 500x) controle controle

28 controle controle

29

30 [P] 1 U = 1 µmol P / min tempo

31 Concentração de atividade enzimática U/mL Concentração de proteína total mg/ml Atividade específica U/mg