Estabilidade Enzimática

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1 Estabilidade Enzimática Biocatálise e Biorremediação 17 de Março de 2016 David Cruz Nº Matteo Melosini Nº Vânia Silva Nº 48242

2 Índice Objectivos... 2 Resumo... 2 Resultados... 3 Meio não aquoso a temperatura ambiente... 3 Meio não aquoso a 70 C... 4 Tratamento de resultados... 5 Discussão

3 Objetivos O objetivo deste trabalho prático consistiu em medir a atividade enzimática da lipase de Candida rugosa (CRL) ao longo do tempo, tendo esta sido incubada em meio aquoso e em n- heptano (solvente orgânico). Pretende-se também avaliar quais os efeitos da temperatura na estabilidade e atividade da enzima em meio aquoso e não aquoso, para isso a enzima foi incubada a diferentes temperaturas nos dois tipos de meio. Resumo Sendo as enzimas biocatalizadores naturais e estando presentes em organismos vivos que são maioritariamente constituídos por água, pode-se pensar que estas são frágeis em meio que não sejam aquosos, ou então que a sua atividade e estabilidade fosse maior em meios aquosos. Devido às grandes vantagens destas proteínas, começaram a ser usadas em muitos processos industriais com o objetivo de catalisar diversas reações. No entanto, muitas reações não ocorrem em meio aquoso mas sim em solventes orgânicos, portanto começou-se a questionar sobre a estabilidade destas macromoléculas neste tipo de meios. Estudos revelaram que, existem duas regras fundamentais para as enzimas manterem a sua atividade em solventes orgânicos. A primeira é conhecer a natureza do solvente, sendo os solventes hidrofóbicos os que apresentaram melhores resultados. Isto acontece pois solventes mais hidrofílicos, tem maior capacidade para retirar água à enzima, fazendo com que a sua atividade reduza drasticamente. A segunda regra é que as enzimas para serem usadas em solventes orgânicos necessitam de ser liofilizadas a partir de soluções aquosas a ph óptimo. Isto dá-se ao facto das enzimas apresentarem uma espécie de "memória de ph" quando presentes em solventes orgânicos. É ainda sabido que, quando se têm uma enzima num meio orgânico, a água presente neste sistema está em equilíbrio entre a enzima e o meio. Neste trabalho, a enzima foi incubada em meio aquoso e não aquoso (n-heptano) com diferentes intervalos de tempo e a temperaturas diferentes, sendo que estas variam desde da temperatura ambiente até 70 C. Esta enzima é responsável pela reação de hidrólise em meio aquoso do substrato usado neste trabalho prático, o p-nitrofenilbutirato (p-npb), que origina p-nitrofenol e ácido butírico. Uma vez que p-nitrofenol confere cor amarela através da medição da absorvância (λ=400nm), pretende-se avaliar a estabilidade da CRL em meio aquoso e não aquoso às diferentes temperaturas e tempos de incubação. 2

4 Absorvância (400 nm) Resultados De seguida apresenta-se os gráficos obtidos das absorvâncias em função do tempo, de onde pudemos retirar os valores de atividade enzimática, nos ensaios em meio não aquoso a temperatura ambiente e em meio aquoso a 70 C. Meio não aquoso a temperatura ambiente 0,9 0,8 0,7 0,6 y = 0,0099x + 0,2309 R² = 0,9866 y = 0,0057x + 0,1205 R² = 0,9992 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0009x + 0,1028 R² = 0, Tempo (s) 5 min 20 min 40 Figura 1- Gráfico da absorvância (400 nm) em função do tempo (s) para a enzima incubada em n-heptano à temperatura ambiente, após períodos de incubação de 5 (), 20 ( ) e 40 () minutos. Utilizou-se a equação 1, onde a partir do declive das retas obtidas nos diferentes tempos de incubação (tabelas 3 e 6), das massas de enzima usadas (tabelas 1 e 5), da absortividade molar (ε), da distância percorrida pela radiação na solução (l ) e do volume da solução a que foi medida a absorvância (tabela 2) é possível calcular a atividade enzimática nos diferentes ensaios (tabelas 4 e 7). Equação 1 Cálculo da atividade enzimática atividade enzimática = Declive (s 1 ) Volume (dm 3 ) 10 9 (nmol) ε (M 1 cm 1 ) l (cm) massa enzima (mg) Tabela 1 - Massa de lípase utilizada nos diferentes tempos de incubação Tempo de incubação (min) Massa de enzima (mg) 5 2,1 20 1,9 40 2,7 3

5 Absorvância (400 nm) Tabela 2 - Dados necessários para a resolução da fórmula para o cálculo da atividade enzimática. Volume (dm 3 ) ε (M -1.cm -1 ) l (cm) , Tabela 3 - Declives das retas nos diferentes tempos de incubação Tempo de incubação (min) Declive da reta (s -1 ) Tabela 4 - Actividade enzimática da lipase aos diferentes tempos de incubação em meio orgânico (n-heptano) à temperatura ambiente. Tempo de incubação (min) Actividade enzimática (nmol s-1 mg-1) 5 10, , , Meio não aquoso a 70 C 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 y = 0,0038x + 0,1664 R² = 0,9993 y = 0,0034x + 0,0925 R² = 0,9986 y = 0,0009x + 0,0543 R² = 0, Tempo (s) 5 min min Figura 2 Gráfico da absorvância (400 nm) em função do tempo (s) para a enzima incubada em n-heptano a 70ºC, após períodos de incubação de 5 (), 20 ( ) e 40 () minutos. 4

6 Tabela 5 - Massa de lípase utilizada nos diferentes tempos de incubação Tempo de incubação (min) Massa de enzima (mg) ,1 40 2,2 Tabela 6 - Declives das retas nos diferentes tempos de incubação Tempo de incubação (min) Declive da reta (s -1 ) Tabela 7 - Atividade enzimática da lipase aos diferentes tempos de incubação em meio orgânico (n-heptano) a 70ºC. Tempo de incubação (min) Actividade enzimática (nmol s-1 mg-1) 5 3, , , Tratamento de resultados Para medir o tempo que duraria a reação de consumo total pnpb em meio aquoso à temperatura ambiente, sabendo que a velocidade de reação se mantinha constante foi aplicado o seguinte procedimento: Assumindo que a velocidade de consumo de substrato é igual a velocidade de produção de produto (p-nitrofenol) devido à estequiometria da reação de 1:1. pnpb + Água p nitrofenol + ácido butírico Através da Lei de Lamber-Beer foi calculada a concentração molar de produto ao tempo de 120 segundos (1,217 x 10-5 ). A molaridade obtida foi convertida em número de moles de produto multiplicando pelo volume (10-3 dm -3 ) e utilizado como referência para moles consumidas de substrato. A partir da concentração de substrato (30 mm) e do seu volume pipetado (10 μl) foi calculado o numero de moles inicial de substrato. Através da proporção estequiométrica foi possível obter um valor correspondente ao tempo no qual o substrato é totalmente consumido (cerca 7 minutos desde do inicio da reação). Cálculos A 400nm (120 s) = 0,224 5

7 C = A ε (M 1 cm 1 ) l (cm) = 1, dm 3 = 1, mol Produto 30 mm = mol dm mol dm dm 3 = mol Substrato , = Tempo 120 s Tempo = 295 s Tempo Total = = 415 s 7 min 6

8 Discussão Os nossos resultados permitem comparar a actividade enzimática em meio orgânico entre duas temperaturas, temperatura ambiente e a 70ºC. Apesar da incoerência dos resultados obtidos para 5 minutos de incubação, à temperatura ambiente, e para os 40 minutos de incubação a 70ºC, é possivel visualizar que o tempo de incubação da enzima não aparenta ser um parâmetro que tenha influência na actividade enzimática. A incoerência dos valores podem ser explicados por possiveis erros experimentais, como por exemplo o uso de uma menor quantidade de enzima nos ensaios respectivos. Tambem foi possivel comparar os nossos resultados em relação às diferentes temperaturas de incubação, onde foi possivel verificar que a temperaturas maiores (70ºC) a actividade enzimática reduziu comparativamente aos ensaios realizados à temperatura ambiente. Estes resultados não coincidem com a literatura pois, esta diz que a termo-inactivação de uma enzima necessita de água livre no sistema e sendo a termoresistência de uma enzima uma função entre a natureza do solvente e do ph da solução aquosa de onde a enzima é liofilizada. Nos resultados obtidos não devia ser esperado uma redução da actividade na incubação a 70ºC no meio orgânico, pois este contêm uma baixa percentagem de água o que impede conformacionalmente a inactivação da enzima. No entanto estes resultados podem ser explicados pelo facto do solvente ter absorvido água na execução do ensaio fazendo com que a enzima conseguisse perder actividade. (artigo100ºc) Analizando os resultados obtidos pelo resto dos grupos que realizaram este trabalho prático, é possivel verificar que em meio aquoso o aumento da temperatura de incubação causa uma diminuição na actividade enzimática. Isto acontece devido ao aquecimento provocar a desnaturação da proteina e sendo estes ensaios em meio aquoso a enzima tem tambem liberdade conformacional para desnaturar, perdendo assim as suas funções e baixando a sua actividade. Quanto aos tempos de incubação foi ainda visivel que em tempos de incubação curtos a enzima consegue aguentar condições mais extremas, no que diz respeito à temperatura, no entanto ao aumentar estes periodos de incubação a enzima desnatura, acabando por apresentar uma actividade praticamente nula. Isto acontece devido às propriedades de termo-resistência das proteinas. À temperatura ambiente foi observado que os tempos de incubação mais longos não apresentavam grande impacto na actividade enzimática, o que é explicável por estas apresentarem uma grande estabilidade em meios aquosos que não apresentem condições extremas. Quanto aos ensaios em meio não aquoso, expôr a enzima a temperaturas mais elevadas não parece causar uma grande perda na actividade enzimática. Isto pode ser explicado pelo facto de o solvente orgânico não apresentar uma quantidade de água suficiente que permita à enzima ter mobilidade para desnaturar, conservando assim as suas funções e sua actividade. Os tempos de incubação mais longos tambem não aparentam ser um factor critico em relação à actividade enzimática. A actividade so diminui quando foram usadas temperaturas elevadas em combinação com tempos de incubação maiores, no entanto esta diminuição não foi tão grande como em meio aquoso. Concluindo, os resultados mostram que a enzima parece ser termodinâmicamente mais estável em meios não aquosos, podendo aguentar condições mais extremas de temperatura durante maiores periodos de tempo, mantendo quase sempre valores de actividade enzimática maiores do que em meio aquoso. 7

9 Os resultados de todos os grupos que procederam a este trabalho prático parecem ser consistentes em comparação com a literatura que explica este fenómeno através do facto da enzima ao estar num meio com baixo teor em água, não tem tanta mobilidade para desnaturar e perder a sua função. No entanto também é importante salientar que as caracteristicas do solvente (como por exemplo a hidrofobicidade) podem influenciar a actividade enzimática ou o tipo de produto da reacção caso a enzima seja enatioselectiva. (artigo enatioselectivity) 8