DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE TRIGLICÉRIDOS E COLESTEROL

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1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE TRIGLICÉRIDOS E COLESTEROL Determinação da concentração plasmática de triglicéridos por um método enzimático O conteúdo em triglicéridos pode ser determinado através da acção sequencial de 4 enzimas, lipase, glicerocinase, glicerol-3-fosfato oxidase e peroxidase. O indicador quinoneimina é formado pela reacção do peróxido de hidrogénio e 4-aminoantipirina, na presença de fenol e peroxidase. Triglicéridos Lipase Glicerol + Ácidos gordos Glicerol + ATP Glicerocinase Glicerol-3-fosfato + ADP Glicerol-3-fosfato oxidase Glicerol-3-fosfato Dihidroxiacetona-fosfato + H 2 O 2 2H 2 O 2 + Paraclorofenol + 4-Amino-antipirina Peroxidase Quinoneimina + 4 H 2 O

2 COLESTEROL E COLESTEROLÉMIA Colesterol O colesterol pode ser encontrado no organismo sob várias formas: Colesterol total Colesterol livre Colesterol esterificado. * Fontes de colesterol - Origem endógena (a maior parte, cerca de 2/ 3), por síntese no fígado (50%), intestino e pele. - Origem exógena (ovos, fígado, carne e cérebro). * Funções do colesterol O colesterol é sintetizado a partir de Acetil-CoA e faz parte da estrutura das membranas celulares, sendo também o precursor das hormonas esteróides e dos sais biliares. Colesterolémia normal: mg% - Colesterol livre: 25% - Colesterol esterificado: 75% Hipercolesterolémia - Causas possíveis: - Icterícia obstructiva - Aterosclerose - Hipotiroidismo - Síndrome nefrótico - Diabetes Mellitus - Hereditária, familiar (diferentes tipos) - Obesidade - Excesso de consumo de álcool 1

3 Hipocolesterolémia - Causas prováveis: - Insuficiência hepática (diminuição dos ésteres de colesterol) - Hipertiroidismo - Hereditária - Abetalipoproteinémia congénita: diminuição do colesterol total (CT) e triglicéridos (TG) - Diminuição da alfa lipoproteína (Doença de Tangier, diminuição do CT e aumento dos TG) * Determinação da colesterolémia por um método enzimático: O conteúdo em colesterol pode ser determinado após hidrólise e oxidação enzimática. O indicador quinoneimina é formado pela reacção do peróxido de hidrogénio e 4- aminoantipirina, na presença de fenol e peroxidase, tal como demonstrado pelas seguintes reacções (1, 2 e 3): Colesterol Esterase 1) Éster de colesterol + H 2 O Colesterol + Ácidos gordos Colesterol oxidase 2) Colesterol + O 2 Colesterol-4-ene-3-ona + H 2 O 2 Peroxidase 3) 2 H 2 O 2 +Fenol + 4-Aminoantipirina Quinoneimina + H 2 O 2

4 PROTOCOLO DE BANCADA DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE TRIGLICÉRIDOS e COLESTEROL A - Concentração plasmática dos triglicéridos Amostra: soro ou plasma isolado de sangue colhido em heparina ou EDTA. Padrão: Glicerol 2,29 mm (200 mg/dl = 2 g/l) Reagentes (kit RANDOX TR 210): - Reagente 1 (tampão): Tampão Pipes (40 mm) ph 7,6, Paraclorofenol (2,7 mm), Magnésio (4 mm) - Reagente 2 (enzimas): Amino-antipirina (0,4 mm), Lipase (1000 U/l), Glicerocinase (200 U/l), Glicerol-3- fosfato oxidase (2000 U/l), Peroxidase (200 U/l), ATP (0,8 mm) - Reagente 3: Padrão de Glicerol - Solução enzimática: Reconstituição do Reagente 2 com todo o conteúdo do Reagente 1; Estabilidade: 5 dias 20-25ºC ou 1 mês 2-8ºC. Nota: este passo já foi feito antes da aula prática. 1. Prepare as cuvettes branco, padrão e amostra: Branco Padrão Amostra Reagente 3 (Padrão) µl Amostra µl Solução enzimática 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml (Reagente 2) DO (λ = 500 nm) 2. Misture e incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. 3. Leia a absorvância da amostra e do padrão, contra o branco (zero), a 500 nm. A intensidade de cor é estável durante 30 minutos Linearidade: 11,4 mm (1000 mg% = 10 g/l)

5 Cálculos: [Triglicéridos] = Abs 500nm (amostra) Abs 500nm (padrão) X Concentração do Padrão Valores de referência: Mulheres: 0,46 1,60 mm; mg% = 0,4-1,4 g/l. Homens: 0,68 1,88 mm; mg% = 0,6-1,65 g/l. NOTA: Dever-se-á ainda considerar a quantidade de glicerol livre do plasma: o valor de 0,11 mm ou 10 mg% (0,1 g/l) é geralmente descontado ao valor final da concentração de triglicéridos. B - COLESTEROLÉMIA: concentração plasmática do colesterol Amostra: soro, plasma heparinizado ou plasma isolados de sangue colhido em EDTA. Padrão: 5,17 mm (200 mg/ dl) colesterol Reagente: - 4-Aminoantipirina 0,3 mm - Fenol 6 mm - Peroxidase > 0,5U/ ml - Colesterol oxidase > 0,1U/ ml - Colesterol esterase > 0,15U/ ml - Tampão PIPES 80 mm, ph 6,8 1. Prepare as cuvettes branco, padrão e amostra: Branco Padrão Amostra Padrão µl Amostra µl Solução enzimática 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml (Reagente) DO (λ = 500 nm) 2

6 2. Homogenize os tubos e Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos. 3. Leia a absorvância a 500 nm. Cálculos: [Colesterol] = Abs 500nm (amostras) Abs 500nm (padrão) X Concentração do Padrão Valores referência: <5,17 mm (200 mg/ dl ) Colesterolémia desejável 5,17-6,18 mm ( mg/ dl) Limite inferior para colesterolémia elevada > 6,2 mm (240 mg/ dl) Alto valor de colesterol no sangue 3

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