Engenharia Biomédica. Relatório Cinética da Enzima Invertase

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1 Engenharia Biomédica Bioquímica e Biologia Molecular Relatório Cinética da Enzima Invertase Relatório realizado por: Ana Calhau nº54605 Dárcio Silva nº54214 José Frazão nº º Semestre, Ano Lectivo 2005/2006

2 Sumário Usam-se diversas abordagens no estudo do mecanismo de acção de enzimas purificadas, mas a abordagem principal é determinar a taxa da reacção enzimática e como muda em resposta à mudança dos parâmetros experimentais, esta é conhecida como cinética enzimática. Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cinética da enzima invertase, ou seja, determinar o valor da velocidade máxima (máxima velocidade a que a enzima degrada o substrato) e determinar o valor do K m que é uma medida da afinidade enzimática para o substrato (essa afinidade é igual a 1/k m ). Se K m for elevado a afinidade é baixa. A invertase é uma enzima que catalisa a degradação da sacarose em glucose e frutose. Inicialmente, obteve-se a absorvância e a concentração dos açúcares redutores (tendo-se feito dois ensaios). Depois, calculou-se a velocidade de reacção para cada concentração inicial de sacarose. Para se obter os valores usou-se a equação da recta Y=0,0004x-0,0186, em que Y é a absorvância. Em seguida colocaram-se estes resultados num gráfico (concentração de sacarose x velocidade de reacção), obtendo-se uma curva de Michaelis-Menten (fig.1). Fig.1 Variação da velocidade de reacção em função da concentração de substracto curva de Michaelis-Menten. Esta curva é descrita pela equação que leva o mesmo nome: Apesar de ser possível calcular o valor de K m e da velocidade máxima através desta curva é frequente utilizar-se a representação gráfica de 1/v em função de 1/[S] representação de Lineweaver-Burkpois torna mais simples o estudo da cinética bioquímica, já que o

3 traçado de uma recta exige menos leituras experimentais (menos pontos) do que o da curva e permite uma determinação de Km mais expedita. Fig.2 Representação de Lineweaver-Burk para a determinação de Km Esta representação é descrita pela equação Assim, o objectivo de estudar a cinemática da enzima invertase foi alcançado, obtendo-se valores de Km iguais a 12,52 g/l (36,6mM) pela interpretação linear de Lineweaver-Burk e de 11,5 g/l (33,6mM) pela interpretação de Michaelis Menten. Os valores da velocidade máxima foram de 1,84g/(L.min) e 1,6 g/(l.min) respectivamente.

4 Resultados Nos primeiros resultados, após se ler a densidade óptica, obtiveram-se logo valores máximos para a velocidade. Assim, reduziu-se a quantidade de invertase utilizada. Após a redução a 1/5 de invertase quantos aos resultados, obteve-se, relativamente à cor, que esta passava de transparente para amarelo, após adição da invertase, qualquer que fosse a concentração de sacarose. Após passagem pelo banho de água a 100ºC passava a castanho. Contudo, para os tubos aos quais não foi adicionado invertase e que correspondem ao tempo zero para cada uma das concentrações de sacarose verificou-se a passagem do transparente para o amarelo e a permanência desta cor. Quanto aos valores obtidos para a absorvância e para a concentração os resultados são os seguintes: Valores obtidos para as concentrações de 15, 30 e 45 g/l Ensaio 1 sacarose 15g/L 0 0,1 296, ,24 646, , , , , , ,1 2796, ,2 3046, , ,5 420 sacarose 30g/L 0 0, , , , , , , , , , , ,5 420

5 sacarose 45g/L 0 0,018 91, , , , , , , , , , Ensaio 2 sacarose 15g/L 0 0, ,5 1 0, , , , , , , , , , , , , sacarose 30g/L 0 0, , , , , , , , , , sacarose 45g/L 0 0, ,

6 2 1, , , , , , , , , , ,5 420 Valores obtidos para as concentrações de 45, 60 e 75 g/l Ensaio 1 sacarose 60 g/l 0 0,008 66,5 1 0, , , , , , , , , , sacarose 75g/L 0 0, , , , , , , , , , , , , ,5 420 sacarose 100g/L 0 0, , , , ,5 120

7 3 1, , , , , , , ,5 420 Ensaio 2 sacarose 60 g/l 0 Absorvância [] (mg/l) Tempo (s) 0, , , , , , , , , , , , , , , , sacarose 75g/L Absorvância [] (mg/l) Tempo (s) 0 0, , , , , , , , , sacarose 100g/L Absorvância [] (mg/l) Tempo (s) 0 0, , , ,4 3546, , , , , , ,

8 7 2, ,5 420 Assim, a média para cada grupo de valores obtidos é: sacarose 15g/L 0 0, , , , , , , , , , , , sacarose 30g/L 0 0, , , , , , , , , , , , , sacarose 45g/L 0 0, , , , , , , , , , , , , , , ,75 420

9 sacarose 60g/L 0 0,008 66, , , , , , , , , , , sacarose 75g/L 0 0, , , , , , , , , , , , , ,5 420 sacarose 100 g/l 0 0, , , , , , , , , , , , ,5 420

10 Desta forma, graficamente obtemos: 8 7 Conc de Açucares Reduzidos (g/l) Conc.S acarose 15g/L Conc.S acarose 30g/L Conc.S acarose 45g/L Conc.S acarose 60g/L Conc.S acarose 75g/L Conc.S acarose 100g/L Tempo (min) Pelo cálculo do declive das rectas anteriores obtém-se a curva de Michaelis-Menten: 1,8 1,6 1,4 Velcidades (g/l.min) 1,2 1 0,8 0,6 Série2 0,4 0, Conc. Sacarose (g/l)

11 Desta forma (pela aplicação das fórmulas apresentadas no sumário), obtém-se: K m =11,5 g/l (33,6mM) V máx =1,6 g/(l.min) Pela inversão dos valores dos eixos acima obtém-se o gráfico de Lineweaver-Burk: 1,5 y = 6,806x + 0,5435 1,3 1,1 0,9 0,7 0,5 Série1 Linear (Série1) 0,3 0,1-0,1-0,05 0 0,05 0,1-0,1-0,3-0,5 1/[ ] Mais uma vez, pela aplicação das fórmulas apresentadas no sumário, obtém-se: K m =12,52 g/l (36,6mM) V máx =1,84 g/(l.min)

12 Discussão Os primeiros resultados obtidos evidenciaram, muito inicialmente, valores de velocidade máxima, uma vez que, a reacção deu-se muito depressa devido ao excesso de produto, ou seja, utilizou-se enzima em excesso, tendo-se, posteriormente, devido a tal acontecimento, diminuído a sua quantidade em 1/5. Quanto à coloração obtida, verifica-se que, apenas para o tubo correspondente ao tempo zero esta não muda pois não foi adicionada invertase, que ao reagir provoca o escurecimento da solução. Para a construção dos gráficos e cálculo das médias foram desprezados valores, os correspondentes a tempos diferentes e valores em que a velocidade máxima era rapidamente atingida. Para o gráfico da concentração de açucares reduzidos (g/l) por unidade de tempo (s) foi desprezado um valor correspondente ao tubo 5 de concentração 30g/L por apresentar um valor anómalo derivado a um erro de leitura. O valor teórico de K m para a enzima invertase (segundo o Brenda) é de 14,09 g/l (41,02mM). O valor obtido neste trabalho experimental foi diferente do valor teórico possivelmente porque as condições requeridas para estipular um valor tabelado são muito mais exigentes e precisas do que as que conseguidas numa aula laboratorial. Por outro lado, foi também diferente o valor de Km obtido, dependendo este da representação utilizada a de Michaelis-Menten (K m =11,5 g/l (33,6mM)) ou a de Lineweaver-Burk (K m =12,52 g/l (36,6mM)) - devido à diferente precisão dos métodos. Contudo, verificase, nitidamente, que o valor obtido pela recta de Lineweaver-Burk é bem mais aproximado ao teórico, devido, precisamente, à sua maior precisão. Várias podem ter sido as razões que explicam a diferença entre os valores obtidos e os teóricos, assim como a diferenças nos ensaios para iguais concentrações de sacarose. Destacam-se: - A impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45ºC a solução de sacarose esta estivesse exactamente a 45º, visto que o sistema é partilhado por 4 grupos o que pode originar pequenas oscilações de temperatura, assim como a impossibilidade de garantir que o banho de água estivesse a 100ºC pelas mesmas razões. - O próprio facto de se agitar o tubo de forma diferente e durante tempos diferentes após de adicionar a invertase pode influenciar o resultado, uma vez que, se formam agregados mais ou menos maiores;

13 - Mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros ao pipetar e ao transferir para o recipiente; - O facto de ser impossível cumprir escrupulosamente com os tempos estipulados no protocolo; - Aproximações no tratamento dos resultados; - Erros de leitura no espectrofotómetro, nomeadamente, erros de paralaxe, uma vez que os valores foram lidos por nós; - O facto de terem sido desprezados vários pontos no traçado das rectas cujo declive dá a velocidade. A escolha dos pontos pode não ter sido a mais correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinação das constantes cinéticas, pode ter ocorrido propagação de erros. Contudo, apesar de todas as diferenças verificadas, pode concluir-se que se obteve valores aceitáveis de K m e de velocidade máxima (constantes cinéticas) pela leitura da recta de Lineweaver-Burk.

14 Bibliografia Campos, Luís S., Entender a Bioquímica, 4ª edição. Escolar Editora. Lisboa, 2005;