MONITORIZAÇÃO DA DEGRADAÇÃO DO GLICOGÉNIO

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1 MONITORIZAÇÃO DA DEGRADAÇÃO DO GLICOGÉNIO 1. Objectivo Neste trabalho, ir-se-á observar a degradação do glicogénio ao longo tempo: i) em meio ácido e à temperatura de 100ºC (degradação química); ii) em meio neutro, à temperatura ambiente e na presença da enzima amilase (degradação enzimática). O trabalho integra também a construção de uma recta de calibração usando glucose como açúcar redutor de referência. 2. Introdução O glicogénio é um polímero de glucose que actua como reservatório de unidades glicosídicas no tecido animal. Num ser bem alimentado, a glucose é convertida em glicogénio no fígado, glicogénio esse que é hidrolizado a glucose durante o jejum, onde pode ser totalmente consumido em 24 a 48 horas; após este período, os níveis de glucose no sangue são mantidos a partir de fontes não glicídicas. Já a quantidade de glicogénio do músculo não é afectado pela dieta, permanecendo praticamente constante na ausência de exercício violento. O glicogénio muscular não contribui directamente para o teor de glucose do sangue (a enzima glucose-6-fosfatase não existe no músculo) mas pode fazêlo por via indirecta quando se forma lactato durante as contracções musculares em condições anaeróbias. O glicogénio é um polímero ramificado em que a cadeia principal tem ligações glicosídicas (α1 4) e com ramificações em (α1 6). Estruturalmente, é semelhante à amilopectina do amido, o que permite a sua degradação à temperatura ambiente na presença enzima amilase (α-1,4-d-glucan-4-glucanohydrolase, EC ) por hidrólise aleatória das ligações glicosídicas internas α-1,4, sendo o dissacárido maltose o produto final dominante. Na ausência de catalisador enzimático, a degradação só é conseguida em condições muito mais agressivas (temperatura elevada e meio fortemente ácido). A monitorização da degradação do glicogénio baseia-se no aumento de extremidades glicosídicas redutoras que acompanha necessariamente a reacção. De facto, cada cisão numa molécula de glicogénio dá origem a duas extremidades redutoras, a do glicogénio 1

2 remanescente, e a do sacárido entretanto removido. Assim, espera-se que haja um aumento do nº de extremidades redutoras em solução com o tempo da reacção de degradação, quer por via química quer por via enzimática. O teor em extremidades redutoras pode ser aferido através do teste do reagente DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico, DNS, amarelo), que reage com a extremidade redutora do sacárido formando-se ácido 3- amino-5-nitrosalicílico (vermelho acastanhado) e ácido glucónico, de acordo com a reacção: O produto da reacção absorve no visível a λ = 540nm, o que não acontece com o DNS nem com as restantes espécies no meio reaccional. 3. Reagentes e equipamento - Solução de NaOH 1.25M - Solução de HCl 1.5M - Solução de glucose 1mg/ml - Solução de glicogénio 3mg/ml - Solução de amilase comercial 0.5mg/ml diluída em H 2 O (1:120; 1:50; 1:100) - SOLUÇÃO A: Solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico em meio básico (1 g ácido em 200 ml NaOH 2N) - SOLUÇÂO B: Solução de tartarato de sódio e potássio (300g de tartarato em 500 ml H 2 O) - Espectofotómetro do visível - Banhos de água - Vortex - Pipetas automáticas e respectivas pontas - Material corrente do laboratório 2

3 4. Procedimento experimental 4.1. Evolução no tempo da hidrólise do glicogénio em meio ácido a 100ºC (degradação química) Identifique 7 tubos (1-7Q). Junte, a cada um deles: 0.5ml sol. glicogénio 3 mg/ml 0.5 ml sol. HCl 1.5M Coloque 6 tubos num banho em ebulição e retire-os de 4 em 4 minutos aproximadamente (use o cronómetro; registe o tempo em min:seg.) como indicado na tabela abaixo. Adicione ao tubo não colocado no banho (tubo 1Q) 1 ml de NaOH 1.25M e depois 1ml DNS. Quando retirar cada tubo, arrefeça em gelo, junte rapidamente 1 ml de solução NaOH 1.25 M. Verifique se a solução já arrefeceu aprox. até à T amb e junte 1 ml de solução de DNS. Tubo 1Q 2Q 3Q 4Q 5Q 6Q 7Q Tempo (min) no banho em ebulição Após completar a experiência, reúna os tubos (1Q a 7Q). Coloque-os em simultâneo num banho de água em ebulição durante 5 minutos. Ao fim deste tempo retire todos os tubos e arrefeça-os em gelo. Leia a A 540 nm utilizando o tubo 1Q como branco Evolução no tempo da hidrólise do glicogénio em meio neutro à temperatura ambiente na presença de amilase (degradação enzimática) Identifique 7 tubos (1-7E). Junte, a cada um deles: 0.5ml sol. glicogénio 3mg/ml 0.5 ml H 2 O destilada 1 ml sol. amilase (última a ser adicionada) Prepare também uma amostra sem enzima (ASE), juntando num tubo 0.5ml solução de glicogénio e 1.5 ml de H 2 O. Adicione imediatamente 1 ml da solução de DNS ao tubo 1E. Retire os restantes tubos da série (2-7E) de 3 em 3 minutos (use o cronómetro; registe os tempos em min:seg.) como indicado na tabela abaixo e adicione 1 ml de reagente de DNS. 3

4 Tubo 1E 2E 3E 4E 5E 6E 7E ASE Tempo (min) aprox Após completar a experiência, reúna os tubos (1-7E e ASE). Leve todos os tubos, em simultâneo, à ebulição durante 5 minutos. Retire em simultâneo e arrefeça. Leia a A 540 nm contra o tubo 1, que funciona como branco. Meça também a absorvância da ASE. Caso tenha curiosidade, repita a experiência anterior substituindo a solução de amilase comercial por uma solução de saliva (1 gota) em ca. 10 ml de água destilada Construção da recta de calibração para determinação da concentração em açúcar redutor Identifique 6 tubos de ensaio e prepare-os de acordo com o indicado na tabela abaixo: Tubo Sol glucose 1mg/ml (V em µl) H 2 O (V em µl) Adicione a cada tubo 1 ml de reagente de DNS. Leve depois todos os tubos, em simultâneo, à ebulição durante 5 minutos. Retire em simultâneo e arrefeça. Leia as Absorvâncias a 540 nm contra o tubo 0, que funciona como branco. 4

5 5. Bibliografia Plummer DT (1987) An Introduction to practical biochemistry 3rd Ed, McGraw-Hill Book Co (London) pp Rawn J (1983) Biochemistry, Harper & Row Publishers Inc (NY), pp Bohinski RC(1983) Modern Concepts in Biochemistry 4 th Ed, Allyn&Bacon Inc (Boston) pp Protocolo Experimental Monitorização da degradação do Glicogénio DQ, FCT-UNL (2007) 6. Relatório e cálculos 1. Determinação das concentrações das soluções-padrão de glucose. Construção da recta de calibração 2. Construção do gráfico da concentração em açúcar redutor em função do tempo em segundos para as duas situações (hidrólise química e enzimática). Expressão do teor em extremidades redutoras em termos de equivalentes de glucose. 3. Discussão dos resultados tendo em conta: a absorção da ASE; a quantidade de produto formado por hidrólise química e enzimática após um dado período de tempo. 5