DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DE ENZIMAS DA GLICÓLISE EM EXTRACTOS DE CÉLULAS DE LEVEDURA. Glucose + 2Pi + 2ADP + 2NAD! 2CH COCOO " 2ATP " 2NADH " 2 H

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1 DETERMINAÇÃ DA ACTIVIDADE DE ENZIMAS DA GLICÓLISE EM EXTRACTS DE CÉLULAS DE LEVEDURA 1. Introdução A glicólise é um caminho metabólico quase universal no qual a glucose é convertida em piruvato com síntese concomitante de ATP por fosforilação de ADP a nível do substrato. No entanto, apenas uma pequena percentagem da energia total contida na glucose é conservada sob a forma de ATP durante a glicólise, visto que a glucose é apenas parcialmente oxidada. A glicólise pode ocorrer em condições quer aeróbias, quer anaeróbias, sendo a sequência de reacções até à formação de piruvato a mesma em ambos os casos; no entanto, as transformações subsequentes podem ser diversas. A glicólise representa a primeira etapa do processo de fermentação alcoólica em que as leveduras convertem glucose a etanol sob condições anaeróbias. Neste processo, o piruvato obtido a partir da glicólise é primeiramente descarboxilado, originando-se acetaldeído por acção da descarboxilase do piruvato. acetaldeído é subsequentemente reduzido a etanol por acção da desidrogenase do etanol. Balanço global da glicólise: + - Glucose + 2Pi + 2ADP + 2NAD! 2CH CC " 2ATP " 2NADH " 2 H 3 " Balanço global da fermentação alcoólica: Glucose + 2Pi + 2ADP! 2Etanol " 2ATP " 2 C 2 Entre as várias enzimas que intervêm na glicólise, a fosfofrutocinase desempenha um papel chave no controle deste caminho metabólico. É uma enzima alostérica, sendo inibida por elevadas concentrações de ATP e por citrato. A hexocinase e a piruvatocinase são duas enzimas que também participam na regulação da velocidade da glicólise, ambas requerendo a presença de Mg 2+ ou Mn 2+ como co-factor. A hexocinase é inibida alostericamente pelos productos da reacção que catalisa, glucose 6- fosfato e ADP. A piruvatocinase é uma enzima regulatória sujeita a inibição alostérica por concentrações elevadas de ATP e sujeita a activação pela frutose 1,6-bisfosfato e/ou por fosfoenolpiruvato. 1

2 Entre os compostos capazes de inibir a glicólise incluem-se o iodoacetato, que inibe a desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato; o fluoreto, que inibe a enolase (enzima que catalisa a conversão de 2-fosfoglicerato em fosfoenolpiruvato) e o bisulfito, que forma um composto de adição com o acetaldeído o qual deixa de estar disponível para a reacção com o NADH, na última reacção da fermentação alcoólica. ião arsenato, análogo do fosfato, actua como desacoplador, impedindo a conservação de energia na reacção de transformação do 1,3- bifosfoglicerato em 3-fosfoglicerato. 2. Parte experimental No presente trabalho, serão determinadas as actividades das enzimas glicolíticas hexocinase, fosfofrutocinase, piruvato cinase e descarboxilase do piruvato existentes num extracto celular da levedura Saccharomyces cerevisiae de fermento de padeiro. Para obtenção do extracto celular as paredes das células são quebradas devido à acção mecânica produzida por pequenas esferas de vidro. método usado para a determinação das actividades enzimáticas baseia-se no acoplamento da reacção que se pretende estudar com outra reacção que envolva a oxidação (ou redução) de NADH (NAD + ) ou NADPH (NADP + ). Uma vez que o NADH ou NADPH absorvem a 340 nm, a taxa de formação ou consumo destes compostos pode ser seguida a partir da variação da A 340nm ao longo do tempo (# NAD(P)H = 3.4 mm -1 cm -1 ). s substratos e os co-factores da enzima em estudo são fornecidos em concentração suficiente para que não sejam limitantes. Analogamente são criadas as condições experimentais para que todas as reacções que sejam necessárias acoplar à reacção que se pretende estudar não constituam o passo limitante do sistema reaccional. As actividades específicas de cada enzima (quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 mol de substrato por minuto, em condições definidas) são determinadas a partir das taxas de formação/consumo do NADH ou NADPH e da concentração total de proteína presente no extracto celular determinada pelo método de Bradford Preparação dos extractos celulares Adicione aproximadamente 1,5 g de esferas de vidro com diâmetro de 0,5 mm a cada tubo de centrífuga contendo 100 $l de suspenção de células. Agite fortemente o tubo num Vortex por seis períodos de 1min., seguidos de igual tempo de repouso em gelo. Após o tratamento anterior adicione 1,5 ml de tampão TRIS-HCl 10 mm ph 7,6 às células. Pipete a solução para um tubo centrífuga de plástico e centrifugue a 5000 rpm durante 2

3 15 min. Guarde o sobrenadante (extracto celular) num tubo limpo o qual deverá ser mantido permanentemente em gelo durante a realização de todos os ensaios experimentais Preparação do espectrofotómetro Espectrofotómetro Ultrospec 2100 pro (Amersham): 1- Seleccionar SWIFT II - Reaction kinetics. 2- File - New. Definir as condições do ensaio de acordo com a figura seguinte, escrever o nome do ensaio (seta) e fazer K. 3- Run Method 4- No final do ensaio fazer: File Export e gravar o ficheiro (EXCEL). 3

4 2.3. Técnica para determinação da actividade de diversas enzimas glicolíticas Mantenha todas as soluções a utilizar durante os ensaios de determinação da actividade enzimática em gelo. Todos os ensaios são efectuados num volume total de 1ml e relembre que a determinação da actividade enzimática se baseia no acoplamento da reacção principal a reacções que envolvam a oxidação (ou redução) de NADH (NAD + ) ou NADPH (NADP). Uma vez que o NADH ou NADPH absorvem a 340 nm, a taxa de formação ou consumo da forma reduzida pode seguir-se a partir da variação da A 340nm com o tempo. Utilize como branco a solução tampão correspondente a cada uma das enzimas Hexocinase a) Reacção enzimática b) Base do método ATP + D-glucose Mg 2+ ADP + D-glucose-6-fosfato CH 2 ATP ADP Glucose Mg 2+ Hexocinase CH 2 P 3 H 2 Glucose 6-fosfato + NADP + Glucose 6-fosfato desidrogenase CH 2 P 3 H 2 + NADPH + H + 6-Fosfogluconolactona 4

5 c) Mistura reaccional Ensaio 1: Pipete para uma célula de espectrofotómetro os seguintes volumes:! (870-V extracto celular ) $l de tampão cloreto de trietanolamina com MgCl 2 50 mm (ph=7,4)! xx $l de extracto celular! 10 $l de ATP 65 mm! 10 $l de NADP + 48 mm! 10 $l de Glucose 6-fosfato desidrogenase 70 U/ml Coloque a célula no espectrofotómetro, inicie a leitura da A 340nm e quando esta for constante adicione rapidamente 100 $l da solução de glucose a 22% para iniciar a reacção. Ensaio 2: Idêntico ao ensaio 1. Contudo, quando a actividade enzimática, após a adição de glucose, estiver bem definida adicione 30 $l de ADP 120 mm. Ensaio 3: Idêntico ao ensaio 1. Contudo, quando a actividade enzimática, após a adição de glucose, estiver bem definida adicione 30 $l de Glucose-6-P 0.1 M. Ensaio 4: Idêntico ao ensaio 1 mas substituindo o tampão cloreto de trietanolamina com MgCl 2 10 mm (ph=7,4) por tampão cloreto de trietanolamina sem MgCl 2 10 mm (ph=7,4). 5

6 Fosfofrutocinase a) Reacção enzimática ATP + D- frutose 6-fosfato b) Base do método Mg 2+ ADP + D-frutose 1,6- -bifosfato CH 2 P 3 H 2 CH 2 Frutose 6-fosfato ATP Mg 2+ ADP Fosfofrutocinase CH 2 P 3 H 2 Frutose 1,6-bisfosfato CH 2 P 3 H 2 C C P 3 H 2 CH 2 Fosfoenolpiruvato Piruvato cinase K + Mg 2+ ADP ATP C C Ácido pirúvico Lactato desidrogenase NADH NAD + C CH Ácido láctico 6

7 c) Mistura reaccional Ensaio 1: Pipete para uma célula de espectrofotómetro os seguintes volumes:! (850-V extracto celular ) $l de Tampão: Imidazol 50mM com MgCl 2 10 mm (ph=7,0)! xx $l de extracto celular! 10 $l de Frutose 6-fosfato 100 mm! 10 $l de Fosfoenolpiruvato 100 mm! 10 $l de Piruvato cinase 500 U/ml! 10 $l de Lactato desidrogenase 500 U/ml! 10 $l de NADH 24 mm Coloque a célula no espectrofotómetro, inicie a leitura da A 340nm e quando esta for constante adicione rapidamente 100 $l ATP 0.1 M para iniciar a reacção. 7

8 Piruvato cinase a) Reacção enzimática Fosfoenolpiruvato + ADP K +, Mg 2+ Piruvato + ATP b) Base do método C ADP ATP C NADH NAD C C P 3 H 2 CH 2 Fosfoenolpiruvato K + ; Mg 2+ Piruvato cinase C Ácido pirúvico Lactato desidrogenase CH Ácido láctico c) Mistura reaccional Ensaio 1: Pipete para uma célula de espectrofotómetro os seguintes volumes:! (900-V extracto celular ) $l de tampão: Imidazol 50mM com MgCl 2 10 mm e KCl 10 mm (ph=7,0)! xx $l de extracto celular! 20 $l de Frutose 1,6-bisfosfato (activador da enzima) 120 mm! 10 $l de ADP 120 mm! 10 $l de NADH 24 mm! 10 $l de Lactato desidrogenase 500 U/ml Coloque a célula no espectrofotómetro, inicie a leitura da A 340nm e quando esta for constante adicione rapidamente 50 $l de fosfoenolpiruvato 120 mm para iniciar a reacção. Ensaio 2: Idêntico ao ensaio 1. Mas sem adicionar frutose 1,6-bisfosfato. Ensaio 3: Idêntico ao ensaio 1. Contudo quando a actividade enzimática, após a adição de fosfoenolpiruvato, estiver bem definida adicione 40 $l de ATP 0.5 M. 8

9 Piruvato descarboxilase a) Reacção enzimática Piruvato Acetaldeído + C 2 b) Base do método C C C 2 Piruvato descarboxilase Ácido pirúvico Acetaldeído + H C NADH + H + Álcool desidrogenase CH 2 Etanol c) Mistura reaccional Ensaio 1: Pipete para uma célula de espectrofotómetro os seguintes volumes:! (870-V extracto celular ) $l de tampão fosfato 0,1 M (ph=6,5)! xx $l de extracto celular! 10 $l de Tiaminopirofosfato (cocarboxilase) 30 mm! 10 $l de NADH 24 mm! 10 $l de Álcool desidrogenase 50 U/ml Coloque a célula no espectrofotómetro, inicie a leitura da A 340nm e quando esta for constante adicione rapidamente 100 $l de piruvato 360 mm para iniciar a reacção. Ensaio 2: Idêntico ao ensaio 1. Mas sem adicionar o co-factor da enzima. 9

10 2.4. Técnicas para doseamento de proteína Preparação da curva padrão com albumina 1) A partir de uma solução de albumina de soro bovino com a concentração de 1 mg/ml em tampão fosfato 0,1 M e ph=6,5, prepare as soluções indicadas na tabela seguinte: BSA ($l) H 2 ($l) ) Retire 10 $l de cada uma das soluções anteriores para eppendorf s e adicione 1 ml de reagente de Bradford. Aguarde 5 a 10 min. e leia a A 595nm. Determinação da quantidade total de proteína no extracto celular pelo método de Bradford 1 Prepare cinco soluções de acordo com a tabela seguinte: V extracto celular ($l) V água ($l) Adicione a cada uma das soluções 1 ml de reagente de Bradford. Aguarde 5-10 min. e leia A 595nm. 1 Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72,

11 QUESTINÁRI 1. Determine a quantidade total de proteína (em mg) presente na amostra que preparou a partir de 100 µl de suspensão de células. Apresente, em anexo, a recta de calibração para a albumina de soro bovino, obtida pelo método de Bradford. 2. Apresente os resultados que obteve para cada uma das enzimas estudadas, preenchendo a seguinte tabela (apresente os gráficos e cálculos em anexo). Descreva e justifique os resultados. ENZIMA ENSAI ACTIVIDADE ENZIMÁTICA (mm.min -1 ) ACTIVIDADE ESPECÍFICA (mm.min -1.mg -1 ) 1 Hexocinase Fosfofrutocinase 1 1 Piruvato cinase 2 3 Piruvato 1 descarboxilase 2 3. Recorra às equações reaccionais e descreva qual o comportamento que deveria observar para as enzimas em estudo, caso os seus resultados não tenham sido os esperados. Simule, sob a forma de gráficos, a variação da absorvância a 340 nm com o tempo. 4. Sugira experiências adicionais que poderia efectuar com as enzimas estudadas ou outras de interesse. Apresente e descreva as equações das reacções enzimáticas envolvidas. 11