Funcional de Saccharomyces cerevisiae durante fermentação

Transcrição

1 Bioenergética e Genética Funcional de Saccharomyces cerevisiae durante fermentação vinária durante a (Functional Genomics and Bioenergetics of Saccharomyces cerevisiae during winemaking) 100º Curso de Vinificação EVB Anadia, 5 de Setembro de 2006

2 Saccharomyces cerevisiae, uma fábrica de álcool complexa Simples morfologicamente Muito complexa internamente

3 Fermentação alcoólica, uma defesa contra o stress Equação da Respiração: C 6 H 12 O 6 + 6O 6CO H 2O + 36ATP + Calor + Células Equação da Fermentação Alcoólica: C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 +2ATP+ Calor+ Prod. 2 os +Células Rendimento energético muito baixo Forma de conservação de energia Fermentação completa conduz à estabilidade microbiológica do mosto de uva Acumulação de álcool e o esgotamento da glucose agravam o stress ambiental Mais útil ao Homem que à levedura

4 A fermentação alcoólica e a fermentação vinária, dois conceitos totalmente diferentes Fermentação alcoólica: Meio sintético Glucose 20g/L Processo bioquímico dentro da célula

5 Fermentação alcoólica

6 Fermentação alcoólica CH 3 ı C=O ı COOH Desidrogenase alcoólica Descarboxilase CH 3 I HC=O CH 3 ı HC - OH + CO 2

7 Fermentação alcoólica Dihidroxiacetona desidrogenase NAD + NADH Glicerol-P Glicerol cinase Glicerol CH 3 ı C=O ı COOH Desidrogenase alcoólica Descarboxilase CH 3 I HC=O CH 3 ı HC - OH + CO 2

8 Fermentação vinária >600 compostos químicos! (glucose+frutose) > 200g/L

9 Fermentação vinária Processo microbiológico dentro da cuba Resíduos de Pestícidas Leveduras SO 2 Bactérias Lácticas Fungos Bactérias acéticas

10 A gestão da Na óptica da levedura: Garantir o domínio de S. c. Assegurar uma boa nutrição das células Garantir a integridade das membranas e outros alvos celulares Evitar a presença ou acumulação de toxinas celulares

11 A gestão da Na óptica do enólogo: Garantir a fermentação completa dos açúcares Evitar oxidações e reduções intensas Evitar desvios da fermentação alcoólica Dar especial atenção aos outros processos bioquímicos e químicos Evitar a actividade de bactérias acéticas Controlar a actividade de bactérias lácticas Controlar extracção de matéria corante Controlar a preservação de aromas

12 Descrição do projecto Bioenergética e Genética Funcional de Saccharomyces cerevisiae durante fermentação vinária Objectivo Geral: Caracterizar a performance da levedura durante a durante a (Functional Genomics and Bioenergetics of Saccharomyces cerevisiae during winemaking)

13 Condições experimentais 1. Mosto de uva Branco, tratado com 50 ppm de SO 2, decantado e guardado a 80ºC Descongelado, centrifugado e filtrado sucessivamente por membranas de 1,2µm, 0,45µm e 0.22µm ph 3,32 ; Glucose 109 g/l e Frutose 145 g/l 2. Levedura Estirpe: S. cerevisiae ISA 1000 (isolada a partir de Fermivin) Inóculo: feito a partir de culturas frescas em YPD sólido, em mosto estéril, incubado a 25ºC com agitação orbital durante 15h Inoculação: 1x10 6 células/ml 3. Ensaios Balão de 1L com 800mL de mosto estéril, termostatizado a 25ºC. Agitação magnética fraca Amostragem: 10h, 18h, 36h, 155h

14 10 1 0,1 0,01 Condições experimentais início fase estacionaria final da fermentação 100 fase exponencial 10 início fase exponencial ,1 Tempo (h) D.O. 640nm

15 Resultados Preliminares Parâmetros fisiológicos: 1. Consumo de glucose e frutose e produção de etanol 2. Viabilidade celular e capacidade de redução do azul de metilene (25ºC) 3. Velocidade inicial de transporte de glucose e frutose 4. ph intracelular e determinação do conteúdo em trealose e glicogénio 5. Monitorização in vivo do consumo de glucose e frutose (13C-NMR) Parâmetros bioenergéticos: 1. Permeabilidade das células aos H + capacidade de bombear H +

16 Parâmetros fisiológicos 1. Consumo de glucose e frutose e produção de etanol t (h) 10 D.O. 640nm ,1 0,01 0, Tempo (h) D.O. 640nm p. seco (mg/ml) cél. viáveis (UFC/ml) UFC/ml Cel. totais/ml Cel. viáveis/ml cél. activas (cel./ml) x ,64 6, x x ,2 6, x x 80. cél. totais (cel./ml) 0,804 1,31 1,14x x10 5.6x1 18 2,6 2,3 3.52x x x x10 6

17 Parâmetros fisiológicos 2.Viabilidade celular e capacidade de redução do azul de metilene (25ºC) D.O. 640nm ,1 4,00 3,75 DO phext densidade 3,50 3,25 0,01 3, Tempo (h) D.O. 640nm ,1 ph ext 1,12 1,10 1,08 1,06 1,04 1,02 1,00 0,98 0,96 Densidade 0, Tempo (h) glucose (g/l) frutose (g/l) etanol (g/l)

18 Parâmetros fisiológicos 3. Velocidade inicial de transporte de glucose e frutose Glucose(, ) Frutose (, ) Açúcar Glucose Frutose Início fase exponencial Km (mm) ,0 0,8 0,6 0,4 v (mmolg -1 h -1 ) 1,2 Vmax (mmol g -1 h -1 ) 1,31 1,44 0, [açúcar] (mm) Fase exponencial Km (mm) 35 Vmax (mmol g -1 h -1 ) 0,78 1,035 Início fase estacionária Km (mm) Vmax (mmol g -1 h -1 ) 0,52 0,39 Meio da fase exponencial Fim da fermentação Final da fermentação Km (mm) 5 21 Vmax (mmol g -1 h -1 ) 0,26 0,29

19 Parâmetros fisiológicos 4. ph intracelular e conteúdo em trealose e glicogénio Fase de crescimento Início fase exponencial Fase exponencial Início fase estacionária Final da fermentação Trealose (mg/g) 3,749 7,474 1,297 0,079 Início f. exponencial F. exponencial Glicogénio (mg/g) 3,409 4,755 1,027 0,381 phin 6,40 6,47 6, Unidades arbitrárias Início f. estacionária Final da fermentação phin Trealose Glicogénio

20 Parâmetros fisiológicos Monitorização in vivo do consumo de glucose e frutose (13C-NMR) Frutose (mm) Glucose (mm) A Time (min) Time (min) v (mmolg -1 h -1 ) v (mmolg -1 h -1 ) Consumo de Glucose e frutose, monitorizado on line por 13C-RMN in vivo B [glucose] (mm) [frutose] (mm) (A) Consumo do anómero a ( ) e anómero b ( ) e açucar total (, ). (B) Exemplo das cinéticas de consumo de glucose ( ) e frutose ( ) calculados com base no consumo do açúcar total.

21 Parâmetros bioenergéticos Permeabilidade das células aos H + e capacidade de bombear H + Fase de crescimento Início fase exponencial Fase exponencial Início fase estacionária Final da fermentação Entrada Capacidade passiva de H + de bombar H + (mmol g -1 h -1 ) (mmol g -1 h -1 ) 0,221 0,226 0,699 0,559 0,083 0,507 0,032 0,176 Início f. exponencial F. exponencial Início f. estacionária Final da fermentação

22 phin e ferment. alcoólica

23 O que falta fazer Parâmetros fisiológicos: Monitorização in vivo da produção de produtos finais de fermentação (13C-NMR) Taxa específica de produção de CO 2 (manometria) Actividade das enzimas relacionadas com a produção de etanol (gliceraldeído 3-P desidrogenase, piruvato descarboxilase, álcool desidrogenase e a fosfofrutocinase) Produtos secundários da fermentação (HPLC)

24 O que falta fazer Parâmetros bioenergéticos Conteúdo em ATP ph citoplasmático e vacuolar in vivo (31P-RMN) Polifosfatos e níveis de açucares fosfatados in vivo (31P-RMN) Expressão génica Padrões de inibição de genes relevantes (microarrays) Activação da expressão de genes relevantes (microarrays) Comparação com padrões da fermentação alcoólica laboratorial

25 Agradecimentos Fundação para a Ciência e Tecnologia Pelo financiamento do Projecto POCTI/AGR/47891/2002 Pela Bolsa de Pós-Doc SFRH/BPD/20263/2004 (Prista, C.)