LEVEDURAS E A FERMENTAÇÃO ETANÓLICA

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS Centro de Ciências Agrárias campus Araras LEVEDURAS E A FERMENTAÇÃO ETANÓLICA Prof. Jorge José Corrêa Lopes UFSCar/DTAiSER/CCA campus de Araras/SP jlopes@cca.ufscar.br

2 LEVEDURA AGENTE DA FERMENTAÇÃO 5-10µm

3 A CÉLULA DE LEVEDURA VACÚOLO CICATRIZ CITOPLASMA (FERMENTAÇÃO) NÚCLEO RETÍCULO MITOCÔNDRIAS (CRESCIMENTO) APARELHO DE GOLGI MEMBRANA PLASMÁTICA (TREALOSE)

4 LEVEDURAS MORFOLOGIA UNICELULARES, FREQUENTEMENTES OVAIS, ARREDONDADAS OU ELÍPTICAS. COMPRIMENTO: 5-16 µ LARGURA: 3 7 µ AFETADAS POR DEFICIÊNCIAS DE NUTRIENTES ( P, Mg, Mn, Zn, etc.) E VITAMINAS (BIOTINA, NIACINA, ÁCIDO PANTOTÊNICO E PIRAMIDINA). TAMANHO: 5 VEZES MAIORES QUE AS BACTÉRIAS: PERMITE CENTRIFUGAÇÃO E CONTAGEM DIRETA (NEUBAUER).

5 FIGURA 1: DIAGRAMA DE UMA CÉLULA DE S. cerevisiae

6 PAREDE CELULAR: 30% DO PESO SECO DA CÉLULA. COMPOSIÇÃO: POLÍMEROS DE GLUCANA (CELULOSE), MANANA (GOMAS), QUITINA, LIPÍDEOS, FOSFATOS E ESTERÓIDES. ASPECTO: POROSO (FILTROS)/SELETIVIDADE; PROPRIEDADES PARA SUBSTÂNCIAS < QUE (PM) ATÉ SÍTIO DE ABSORÇÃO. ENZIMAS EXTRACELULARES: INVERTASE, MELIBIASE, GLUCOAMILASE etc. (TRANSLOCAÇÃO E DESDOBRAMENTO DAS FONTES DE ENERGIA PARA O CITOPLASMA).

7 MEMBRANA CITOPLASMÁTICA OU PLASMALEMA. LOCALIZADA ABAIXO DA PAREDE CELULAR DELIMITA EM SEU INTERIOR TODAS AS MICROESTRUTURAS E O HIALOPLASMA. INTEGRIDADE E ESTABILIDADE: CÁTIONS INORGÂNICOS Mg 2+, Ca 2+ e K +. PERMEABILIDADE SELETIVA: CONTROLE DE TRANSLOCAÇÃO DE COMPOSTOS DO MEIO EXTERNO PARA O INTERNO DA CÉLULA E VICE-VERSA.

8 RETÍCULO ENDOSPLASMÁTICO: SÍNTESE DE PROTEÍNAS. VACÚOLO: MEMBRANA VACUOLAR: NATUREZA LIPOPROTEICA. ARMAZENAMENTO TEMPORÁRIO DE POLIFOSFATOS, LIPÍDEOS E ENZIMAS.

9 MITOCONDRIA: PEQUENAS ORGANELAS COM MEMBRANAS UPLAS COM INVAGINAÇÕES INTERNAS ( CRISTAS ). FUNÇÃO: CONVERSÃO DE ENERGIA (ATP) E SÍNTESES DE PROTEÍNAS E RNA. RIBOSSOMOS: SÍNTESE PROTEICA (OCORRE NO CITOPLASMA). NUTRIENTES DE RESERVA: CARBOIDRATOS E LIPÍDEOS. NÚCLEO: DESOXIRIBONUCLEOPROTEÍNAS E RIBONUCLEOPROTEÍNAS.

10 REPRODUÇÃO EM LEVEDURAS BROTAMENTO OU GEMULAÇÃO: MULTIPLICAÇÃO VEGETATIVA (ASSEXUADA). ESPORULAÇÃO: FORMAÇÃO DE ASCOS - SEXUADA (SOB ESTRESSE).

11 CICLO VITAL DE S. cerevisiae (BERGEY S MANUAL 2005).

12 METABOLISMO DAS LEVEDURAS CATABOLISMO ANABOLISMO DEGRADAÇÃO DO SUBSTRATO (FERMENTAÇÃO E RESPIRAÇÃO) SÍNTESE DE MATERIAL CELULAR LIBERAÇÃ0 DE ENERGIA (ATP) ENERGIA PARA SÍNTESE

13 METABOLISMO DAS LEVEDURAS RESPIRAÇÃO:OXIDAÇÃO BIOLÓGICA DE SUBSTRATOS ORGÂNICOS QUE ENVOLVE UM SISTEMA MULTIENZIMÁTICO E O TRANSPORTE DE ELÉTRONS PELA CADEIA RESPIRATÓRIA (STE), RESULTANDO NA FORMAÇÃO DE H 2 O. FERMENTAÇÃO: REAÇÕES EM QUE COMPOSTOS ORGÂNICOS ATUAM COMO SUBSTRATOS E COMO AGENTES DE OXIDAÇÃO, EM UMA SEQUÊNCIA ORDENADA DE REAÇÕES ENZIMÁTICAS.

14 VIA BIOSSINTÉTICA DA DEGRAÇÃO DE CARBOIDRATOS E PRODUÇÃO DE ETANOL POR LEVEDURAS (S. cerevisiae).

15 DESENVOLVIMENTO DAS LEVEDURAS CRESCIMENTO POPULACIONAL: SUPRIMENTO DE NUTRIENTES COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO MEIO COMPOSIÇÃO FÍSICA DO MEIO CONSTITUIÇÃO E ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO DOS MICROORGANISMOS

16 DESENVOLVIMENTO DAS LEVEDURAS É FUNÇÃO DE: CONDIÇÕES DO MEIO NUTRIENTES E ACIDEZ AERAÇÃO E AGITAÇÃO TEMPERATURA

17 CÉLULAS TOTAIS 1 - LAG-FASE 2 FASE DE ACELERAÇÃO DO CRESCIMENTO 3 LOG-FASE OU EXPONENCIAL DE CRESCIMENTO 4 FASE DE DESACELERAÇÃO DO CRESCIMENTO 5 FASE ESTACIONÁRIA 6 FASE DE DECLÍNIO

18 FASES DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE LEVEDURAS 1 - LAG-FASE: ADAPTAÇÃO, RESCONSTITUIÇÃO ENZIMÁTICA, DEGRADAÇÃO MACROMOLECULAR, ETC. É FUNÇÃO DE: LINHAGEM DA LEVEDURA; IDADE DO CULTIVO ANTES D TRANSFERÊNIA PARA O MEIO; COMPOSIÇÕES DOS MEIOS DE CULTICO ANTERIOR E NOVO. 2 FASE DE ACELERAÇÃO: AUMENTO GRADUAL DA VELOCIDADE DE MULTIPLICAÇÃO CELULAR.

19 FASES DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE LEVEDURAS 3 FASE EXPONENCIAL: AUMENTO EXPONENCIAL DO NÚMERO DE CÉLULAS. CADA CÉLULA SE DIVIDE A INTERVALOS CONSTANTES DE TEMPO. CARACTERZA-SE POR: AUMENTO EXPONECIAL DO NÚMERO DE CÉLULAS; INTENSO METABOLISMO CELULAR GRANDE QUANTIDADE DE PRODUTOS DE EXCREÇÃO, METABÓLITOS INTERMEDIÁRIOS, TEMPERATURAS E OUTROS FATORES QUE ALTERAM RAPIDAMENTE A COMPOSIÇÃO DO MEIO; TEMPO DESTA FASE É CONTROLADA PELA COMPOSIÇÃO E ESTADO FÍSCO DO MEIO E DEPENDE DO NÚMERO DE CÉLULAS POR UNIDADE DE VOLUME E ACÚMULO DE METABÓLITOS E PRODUTOS FINAIS (INIBIDORES); A QUANTIIDADE DE INÓCULO NÃO INFLUENCIA O TEMPO DE GERAÇÃONA FASE EXPONENCIAL, MAS RETARDA A FASE DE MULTIPLICAÇÃO CELULAR.

20 FASES DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE LEVEDURAS 4 FASE ESTACIONÁRIA: O NÚMERO DE CÉLULAS PERMANECE QUASE QUE CONSTANTEPOR UM PERÍODO DE TEMPO; HÁ BAIXO CONSUMO DE ENERGIA, MANUTENÇAO DA VIABILIDADE CELULAR ATÉ ESGOTAMENTO DOS NUTRIENTES. É INFULENCIADA POR; ESGOTAMENTO DE NUTRIENTES DO MEIO; ACÚMULO DE PRODUTOS FINAIS TÓXICOS. 5 FASE DE DECLÍNIO: O NÚMERO DE CÉLULAS QUE MORRE EXCEDE O DE CÉLULAS NOVAS, QUE É FUNÇÃO DE: COMPOSIÇÃO DO MEIO (ESGOTAMENTO DO MEIO, ACÚMULO DE PRODUTOS FINAIS,ETC); CONDIÇÕES FÍSICAS E QUÍMICAS DO MEIO( ph, TEMPERATURA,ETC)

21 OBJETIVO DA LEVEDURA REPRODUZIR-SE (CRESCIMENTO) PARA A PERPETUAÇÃO DA ESPÉCIE. O CRESCIMENTO EM ANAEROBIOSE OBRIGA A LEVEDURA A PRODUZIR ETANOL E CO 2. A ESCOLHA DO ETANOL FOI FRUTO DE BILHÕES DE ANOS DE EVOLUÇÃO, PERMITINDO À LEVEDURA MAIOR COMPETITIVIDADE FRENTE A OUTROS ORGANISMOS (AÇÃO ANTISSÉPTICA).

22 OBJETIVO DA LEVEDURA TRANSFORMANDO O AÇÚCAR EM ÁLCOOL A LEVEDURA OBTÉM A ENERGIA (ATP) E MATERIAL NECESSÁRIOS À SOBREVIVÊNCIA E CRESCIMENTO. ÁLCOOL E GÁS CARBÔNICO SÃO PRODUTOS DE EXCREÇÃO, SEM UTILIDADE METABÓLICA PARA A LEVEDURA EM ANAEROBIOSE.

23 CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE LEVEDURAS O ESTUDO DA CINÉTICA DE CULTIVOS MICROBIANOS ESTÁ VOLTADO PARA DOIS GRANDES OBJETIVOS: MEDIR VELOCIDADES DE TRANSFORMAÇÕES QUE OCORREM DURANTE OS PROCESSOS FERMENTATIVOS: COMO CONSUMO DE SUBSTRATOS, ACÚMULO DE PRODUTOS E BIOMASSAS. ESTUDAR A INFLUÊNCIA DE FATORES NAS VELOCIDADESDE TRANSFORMAÇÕES: TEMPERATURAS, ph, GEOMETRIA DOS BIOREATORES, ETC.

24 1.INTRODUÇÃO A CINÉTICA DE CULTIVOS MICROBIANOS PERMITE O CONHECIMENTO DE CONDIÇÕES MAIS FAVORÁVEIS DE SE CONDUZIR E CONTROLAR PROCESSOS FERMENTATIVOS. O ESTUDO CINÉTICO ENVOLVE DUAS PARTES: O TRABALHO EXPERIMENTAL DE COLETA DE DADOS EM LABORATÓRIO, ONDE POCURA-SE MED VELOCIDADES E ESTUDAR À INFLUÊNCIA DE FATORES. APÓS OBTENÇÃO DESSES DADOS, TEM QUE INTERPRETÁ-LOS. DETERMINAR AS VELOCIDADES DE TRANSFORMAÇÕES.

25 Concentração (g/l) [Substrato] tempo [Produto] [Biomassa]

26 QUE VELOCIDADES DEVE-SE DETERMINAR? PARA ESSAS TRANSFORMAÇÕES A VELOCIDADE PODER SER DEFINIDA A PARTIR DO CONSUMO DA SUBSTÂNCIA S OU A PARTIR DA PRODUÇÃO DA SUBSTÂNCIA P OU X. (ds( ds/dt) t 1 = VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO S NO INSTANTE t 1 (g/l.h) (dp( dp/dt) t 1 = VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DE PRODUTO P NO INSTANTE t 1 (g/l.h) (ds( ds/dt) t 1 = VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOMASSA CELULAR X NO INSTANTE t 1 (g/l.h)

27 NO ESTUDO DE PROCESSOS FERMENTATIVOS, AS TRANASFORMAÇÕES SÃO CATALISADAS POR ENZIMAS QUE, SÃO PRODUZIDAS POR MICRORGANISMOS. A CONCENTRAÇÃO DE MICRORGANISMOS PRESENTES NÃO É CONSTANTE COM O TEMPO, DIFICULTANDO COMPARAÇÕES ENTRE instantes CONSECUTIVOS. COMO SOLUCIONAR TAL PROBLEMA? µ = VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO

28 µ S = (1/E). (ds( ds/dt) E = CONCENTRAÇÃO DO COMPLEXO ENZIMA/SUBSTRATO (DIFÍCIL DETERMINAÇÃO EXPERIMENTAL) µ P = (1/E). (dp( dp/dt) µ S = (1/S). (ds( ds/dt) µ P = (1/P). (dp( dp/dt) µ X = (1/X). (dp( dp/dt)

29 2.TEMPO DE GERAÇÃO É O TEMPO NECESSÁRIO PARA QUE A MASSA OU NÚMERO DE MICRORGANISMOS DUPLIQUE. NÚMERO DE CÉLULAS n NÚMERO DE GERAÇÕES (0) X (1) X (2) X (3) X (n) X