Controle Microbiológico nas Usinas de açúcar e álcool. Prof.ª Drª Dejanira de Franceschi de Angelis

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1 Controle Microbiológico nas Usinas de açúcar e álcool Prof.ª Drª Dejanira de Franceschi de Angelis

2 1. OBJETIVO O controle do crescimento da população microbiana dentro de um complexo industrial de açúcar e álcool objetiva essencialmente a diminuição das perdas de matéria-prima e, conseqüentemente, alcançar melhores rendimentos econômicos.

3 2. Água de lavagem da cana Caldo primário Caldo misto Pontos de Amostragem Análises que podem ser realizadas nºbactérias/ml Redução de resazurina Plaqueamento (contagem geral) nºbactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido nºbactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido

4 Caldo antes da sulfitação ou calagem Caldo decantado Mosto e Mel Xarope, água de diluição, caldo cru Mosto antes e após os trocadores de calor nºbactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido nºbactérias/ml Plaqueamento para produtores de goma e ácido Redução de resazurina nºbactérias/ml Redução de resazurina Plaqueamento para produtores de goma e ácido Redução de resazurina Plaqueamento para produtores de goma e ácido

5 Início de alimentação da dorna Final da alimentação nºbactérias/ml nº de células vivas/ml % de viabilidade % de brotamento % de brotos vivos Plaqueamento Leite de leveduras ou cubas nºbactérias/ml % de células vivas % de brotamento % de brotos vivos plaqueamento

6 3. COLETA DE AMOSTRAS As amostras devem ser coletadas com muito cuidado, sempre da mesma forma e por pessoas de alta responsabilidade. Da coleta correta das amostras, acoplado com o bom desenvolvimento laboratorial, depende o resultado de uma empresa. O ideal é que as coletas sejam feitas em frascos inquebráveis, autoclaváveis e transparentes. Existem frascos especiais de coleta, que podem ser autoclavados.

7 Quando as análises são para microbiologia, os frascos são de 200, 300 a 500 ml. As amostras preferencialmente devem ser amostras mistas ou compostas. Uma vez coletadas as amostras, os frascos devem ser fechados e guardados sob refrigeração de 5 ± 2ºC, pelo menor tempo possível. Dependendo da amostra é conveniente anotar no momento da coleta a temperatura e o ph.

8 4. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS A avaliação pode ser feita pelos seguintes métodos principais: MICROSCÓPICA PLAQUEAMENTO FISIOLÓGICA

9 MICROSCÓPICA A análise por contagem microscópica é importante pois permite relacionar possíveis aumentos das bactérias no mosto proveniente das diferentes etapas do processo. Para contagem pode-se empregar várias técnicas, entretanto a câmara de Neubauer é simples e confiável.

10 PLAQUEAMENTO O plaqueamento embora não forneça o resultado imediato pode garantir a viabilidade dos microrganismos presentes além de poder avaliar a presença de microrganismos em volumes maiores.

11 FISIOLÓGICA O método de resazurina permite avaliar de forma relativa a presença de atividade microbiana em função da mudança de cor no corante. A produção de ácido pode ser avaliada e comprovada mediante medida do ph, ou com aplicação de corantes como indicadores. Quanto à produção de goma, que é o resultado da polimerização de açúcares simples glicose e frutose que formam respectivamente dextrana e levana.

12 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Teste da Resazurina Preparar uma solução de NaCl 9 g/l, ajustar o ph a 7,0 com solução de NaOH. Solução de resazurina a 10 mg/l de solução de NaCl 9 g/l. A solução não deve ser estocada por muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz e de altas temperaturas.

13 Preparar tubos com 9 ml de solução de resazurina, tampar com algodão, autoclavar 10 minutos a 121ºC. Nos tubos com resazurina, adicionar 1 ml da amostra. Incubar em estufa ou banho-maria a 37ºC. Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos (violeta-róseo-incolor), estão em relação direta com a atividade microbiana.

14 Modificação da cor (horas) violeta róseo incolor Avaliação da infecção Tratamento - 0,5 3,0 alta imediato 0,5 2,0 4,0 alta imediato 1,0 4,0 6,0 média imediato 3,0 5,0 7,0 fraca normal 3,0 5,0 - desprezível preventivo

15 5.2. Plaqueamento Para este teste deve-se dispor dos seguintes materiais: autoclave; estufa de incubação; placas de petri; tubos para diluição; pipetas; bico de bunsen; algodão reagentes: meios de cultura que podem ser adquiridos prontos ou preparados à partir de seus componentes

16 Preparo do Material: Placas de petri e pipetas devem ser esterilizadas embrulhadas em papel ou em recipientes próprios. A solução salina (NaCl a 0,85%) é colocada no volume de 9 ml em tubos. A seguir tampa-se com algodão e esteriliza-se em autoclave. Os meios de cultura quando preparados devem ser autoclavados para esterilização durante 15 minutos a 121ºC. A amostra a ser analisada deve ser representativa do ponto selecionado.

17 Das amostras são feitas diluições decimais utilizando-se soluções contidas nos tubos. Deve-se diluir a amostra para se atingir entre 30 e 300 UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por placa. Feitas as diluições, seleciona-se as que serão processadas. A seguir, retira-se 0,1 ml do tubo da diluição selecionada e transfere-se para a placa que conterá ou não o meio de cultura, depende da técnica a ser aplicada.

18 Caso a placa não contenha o meio, este deverá ser colocado posteriormente, já liquefeito e a uma temperatura (± 50ºC), vertendo-o sobre a amostra, fazendo-se movimentos em forma de oito para homogeneizá-la no meio antes da solidificação. Caso o meio já tenha sido colocado na placa, este deve estar frio e solidificado ao se colocar a amostra na superfície. Neste caso a amostra é espalhada com auxílio de uma espátula de Drigalsky.

19 Marcar na placa a amostra, a diluição, o volume de amostra e a data do experimento. Após estarem solidificadas, as placas são incubadas a 36ºC (bactérias) ou 28ºC (leveduras). Pode-se aplicar também uma temperatura de 30ºC para bactérias e leveduras. A incubação deve ser de 24 a 48 horas e a seguir as colônias são contadas. O experimento deve sempre ser feito em placas com duplicatas.

20 Ex. de contagem na diluição a 10-3, plaqueando-se 0,1 ml Placa 1: 110 colônias Placa 2: 130 colônias Média: 120 colônias 120 x 10 3 x 0,1 = 1,2 x 10 4 /0,1 ml 120 x 10 3 x (0,1 x 10) = 1,2 x 10 5 UFC/mL

21 5.3. Produção de ácido Amostras de caldo são coletadas nos diferentes pontos do processo em frascos, tubos ou recipientes esterilizados. A seguir são colocadas em uma solução contendo indicador com faixa de variação curta (ex. púrpura de bromocresol ou verde de bromocresol).

22 Ajustar o ph das amostras a ph 6,8 para púrpura de bromocresol e ph 5,0 para verde de bromocresol. Os tubos são incubados a 30ºC e observados de hora em hora. Descartar após 12 ou 24 horas. Quando ocorrer predominância de bactérias ácidas as alterações ocorrem aproximadamente após 3 horas.

23 5.4. Produção de goma Amostras devem ser coletadas como no caso anterior e colocadas diretamente na estufa, caso a presença de goma seja numerosa o meio mostrase em 12 horas turvo e viscoso. Para acelerar a reação é conveniente acrescentar para cada 10 ml de amostra 2 ml de solução esterilizada de extrato de levedura a 20%. O número das bactérias formadoras de goma pode ser determinado pelo meio de Mayeux & Colmer ou ainda pelo meio CSN. As UFC aparecem convexas ou espalhadas, podem ser leitosas ou límpidas.

24 5.5. Técnica de contagem de células ou partículas Rotineiramente emprega-se em Microbiologia a Câmara de Neubauer, considerada como precisa e de leitura rápida para quantificar células de leveduras, esporos, bactérias e outras partículas. A câmara de Neubauer é conhecida por lâmina hematimétrica. Presta-se à contagem de células ou partículas visíveis ao microscópio ótico.

25 As câmaras podem ser simples ou duplas, atualmente apresentam-se espelhadas para realçar a matéria a ser contada. De uma maneira geral tem: 1mm x 1mm x 0,1mm E esta área está dividida em 16 ou 25 quadrados.

26 Quando estiver dividido em 25, cada quadrado terá 0,2mm. Quando estiver dividido em 16, cada quadrado terá 0,25mm. Assim o volume útil de cada quadrado médio é: 0,2mm x 0,2mm x 0,1mm = 0,004mm 3 25 quadrados: 25 x 0,004 = 0,1 mm 3 0,25mm x 0,25mm x 0,1mm = 0,00625mm 3 16 quadrados: 16 x 0,00625 = 0,1mm 3

27

28 RECORDANDO

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30

31 Considerando a profundidade da Câmara (1/10mm) e que as contagens são anotadas em cm 3 (1 cm 3 = 1 ml) o volume de um quadrado grande é: 1mm x 1mm x 0,1mm = 1/10 cm x 1/10 cm x 1/100 cm = = 1/ cm 3 ou 0,0001 cm 3

32 REGRAS DE CONTAGEM 1) Conte as células usando o quadrado grande do centro. 2) Conte as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando as linhas superior e as linhas à direita. 3) Conte cerca de 200 a 250 células antes de determinar o número por cm 3.

33 Nos 25 ou 16 quadrados podem surgir 4 situações: A. Coincidir de haver 200 a 250 células, neste caso conte as mesmas e multiplique por 10 4 para obter o nº de células por cm 3 Ex: 200 células 2 x 10 2 x 10 4 = 2 x 10 6 B. Pode haver menos de 200 células por quadrado grande, neste caso será necessário a contagem de células de alguns quadrados grandes laterais para atingir cerca de 200. Divida o nº de células pelo nº de quadrados grandes e multiplique por 10 4 para achar o nº de células por ml ou cm 3.

34 C. Pode haver mais de 200 células por quadrado grande, neste caso conte as células dos quadrados médios até haver contado cerca de 200. Determine o nº de células de um dos quadrados médios. Multiplique a média por 25 para obter as células por quadrado grande. Este nº x 10 4 fornece o número de células por cm 3. Ex: 210 células em 3 quadrados médios (cada um medindo 0,2 x 0,2mm). Quantas células há por cm 3?

35 210/3 = 70 células por quadrado médio 70 x 25 = 1750 em 0,1mm 3 (1750 células por quadrado grande) 1750 x 10 4 = ou 1,75 x 10 7 cels/cm 3 D. O número de células é muito grande para ser contado. Neste caso a suspensão precisa ser diluída. 1 ml diluído em 9 ml de água ou solução salina é uma diluição de 1:10 ou 1/10, neste caso o nº de células contadas deve ser multiplicado por 10.

36 Cálculos de Porcentagem de células de Leveduras % Viabilidade = vivas x 100 vivas + mortas % Brotamento = brotos x 100 vivas + mortas % Viabilidade dos Brotos = brotos x 100 Br. Vivos + Br. Mortos Flocos por campo (ml) = Flocos nº de quadrados

37 Soluções usadas na Contagem de Leveduras Sol. A Solução de Sulfato Azul de Nilo 20 g de sulfato azul de Nilo em 100 ml de água destilada. Sol. B Solução de Azul de Metileno 0,2 g de azul de metileno em 100 ml de água destilada. USO: solução A + solução B em partes iguais

38 Eritrosina 1 g de eritrosina em 100 ml de água destilada. Diluir 1 ml desta solução em 50 ml de solução tampão (partes iguais de 0,2 M de Na 2 HPO 4 e 0,2 M de NH 2 PO 4 ); ficando solução de corante 1:5000. Guardar em refrigerador. 1 ml (suspensão de células) + 1 ml solução corante

39 BIBLIOGRAFIA LIMA, A. O.; SOARES, J.B.; GRECO, J.B.; GRAUZZI, J.E.; CANÇADO,J.R. Métodos de laboratório aplicados a Clínica 5ª edição pg SHARF, J.M. Métodos recomendados para o exame microbiológico de alimentos Ed. Polígono 1972 pg 239 SUSSMAN, A.S. Microrganismos, Crescimento; Nutrição e Interação Edart SP, 1975 pg 56 58

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