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1 (11) Número de Publicação: PT (51) Classificação Internacional: C12G 1/10 (2006) (12) FASCÍCULO DE PATENTE DE INVENÇÃO (22) Data de pedido: (30) Prioridade(s): (43) Data de publicação do pedido: (73) Titular(es): UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO EDIFÍCIO DA BIBLIOTECA CENTRAL, QUINTA DE PRADOS VILA REAL PT UNIVERSIDADE DO MINHO LARGO DO PAÇO BRAGA PT (72) Inventor(es): ALICE MARIA CORREIA VILELA MOURA MARIA ARLETE MENDES FAIA MANUELA CORTE REAL DORIT SCHULLER PT PT PT PT (74) Mandatário: ANABELA TEIXEIRA DE CARVALHO EDIFICIO OCEANUS - AVENIDA DA BOAVISTA ANDAR SALA 2.1 PORTO PORTO PT (54) Epígrafe: APLICAÇÃO DE LEVEDURAS VÍNICAS IMOBILIZADAS EM CAMADA DUPLA DE ALGINATO- QUITOSANO PARA REMOÇÃO DA ACIDEZ VOLÁTIL EM MOSTOS E VINHOS (57) Resumo: PROCESSO DE REMOÇÃO DA ACIDEZ VOLÁTIL DE MOSTOS E VINHOS CARACTERIZADO POR COLOCAR EM CONTACTO A AMOSTRA DE MOSTOS/VINHOS A TRATAR COM LEVEDURA VÍNICAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE - IMOBILIZADAS NUMA MATRIZ DE DUPLA CAMADA DE ALGINATO- QUITOSANO. AS ESTIRPES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, PODEM SER UTILIZADAS NA FORMA LIVRE OU IMOBILIZADAS EM ESFERAS DE DUPLA CAMADA DE ALGINATO-QUITOSANO.

2 R E S U M O Aplicação de leveduras vínicas imobilizadas em camada dupla de alginato-quitosano para remoção da acidez volátil em mostos e vinhos Processo de remoção da acidez volátil de mostos e vinhos caracterizado por colocar em contacto a amostra de mostos/vinhos a tratar com levedura vínicas Saccharomyces cerevisiae - imobilizadas numa matriz de dupla camada de alginato-quitosano. As estirpes de Saccharomyces cerevisiae, podem ser utilizadas na forma livre ou imobilizadas em esferas de dupla camada de alginatoquitosano.

3 D E S C R I Ç Ã O Aplicação de leveduras vínicas imobilizadas em camada dupla de alginato-quitosano para remoção da acidez volátil em mostos e vinhos Domínio da Invenção A presente invenção diz respeito à redução da acidez volátil de mostos e vinhos com acidez volátil elevada, utilizando leveduras vínicas (Saccharomyces cerevisiae). O processo de desacidificação pode aplicar-se no mosto e/ou durante a vinificação ou directamente no vinho. As leveduras, isto é estirpes de Saccharomyces cerevisiae, podem ser utilizadas na forma livre ou imobilizadas em esferas de dupla camada de alginato-quitosano. Contudo, a utilização de leveduras imobilizadas aumenta significativamente a eficiência do processo de remoção biológica, ou zimológica, do ácido acético. Antecedentes da invenção O vinho é uma bebida alcoólica obtida por fermentação do mosto de uva. O vinho é constituído fundamentalmente por água (componente maioritário), álcool etílico, e por outros componentes, dos quais se destacam os ácidos orgânicos: málico, tartárico, cítrico, acético, propanóico, carbónico entre outros. Alguns ácidos, como o tartárico, o málico e o cítrico não são arrastados pelo vapor de água e constituem a acidez fixa. Outros, como o acético, propanóico e butanóico são voláteis e são responsáveis pela acidez volátil. Os ácidos voláteis são produzidos pelas reacções bioquímicas que ocorrem durante a fermentação e a maturação do vinho. A acidez volátil é um indicador da qualidade do 1

4 vinho e pode ser definida como o conjunto de ácidos gordos da série acética que se encontram no vinho, quer no estado livre quer no estado salificado, cujo limite legal é de 1,2 g/l, expressa em ácido acético (OIV, 2010). O ácido acético pode aparecer nos vinhos por actividade das leveduras durante a fermentação alcoólica e por actividade metabólica das bactérias do ácido láctico e bactérias do ácido acético. A presença de ácido acético nos vinhos tem sido sugerida como uma das causas envolvidas no amuo de fermentações vinárias (Boulton et al., 1996). Por outro lado, mesmo noutras situações em que não ocorrem amuos de fermentação, as concentrações de ácido acético podem exceder os limites legais. Tal facto torna o vinho impróprio para consumo e traduz-se em prejuízos económicos para o produtor. Neste contexto a remoção de ácido acético de mostos ou vinhos é um aspecto relevante para a indústria vinícola. Diversas metodologias, com o objectivo de diminuir a excessiva acidez volátil dos vinhos têm sido propostas, tais como: o Processo 1- Estabilização microbiológica do vinho com acidez volátil elevada, seguido de loteamento com outros vinhos; o Processo 2- Utilização de processos como osmose inversa e nanofiltração(fugelsang e Edwards 2007); o Processo 3- Remoção zimológica do ácido acético por refermentação do vinho ácido (Ribéreau-Gayon et al. 1975; Ribéreau-Gayon et al. 2006). A primeira abordagem (Processo 1) baseia-se na estabilização microbiológica do vinho, com acidez volátil elevada, que é então misturado com outros vinhos com baixo teor em ácido acético. No entanto, o vinho resultante, geralmente, tem reduzido valor comercial (Zoecklein et al. 2

5 1995). Alternativamente, o vinho com excessiva acidez volátil pode ser vendido para fins de destilação para obtenção de etanol, alternativa que também apresenta perdas económicas para o produtor. A osmose inversa e a nanofiltração (Processo 2) podem ser usadas para a desacidificação de vinhos com acidez volátil elevada, porém, estas alternativas utilizadas em conjunto, ou separadamente, envolvem a necessidade da aquisição de equipamento dispendioso nem sempre ao alcance das pequenas e médias empresas vitivinícolas. Várias abordagens têm sido desenvolvidas para a desacidificação biológica de vinhos ácidos, com o objectivo de obter vinhos com um bom equilíbrio entre os teores de açúcar e de ácidos, mas todas elas estão limitadas à remoção do ácido málico e não contemplam a remoção do ácido acético (Bony et al. 1997; Husnik et al. 2006; Husnik et al. 2007; Main et al. 2007; Silva et al. 2003; Sousa et al. 1993; Volschenk et al., 1997). Já existe uma estirpe de levedura geneticamente modificada que diminui substancialmente a quantidade de ácido acético em vinhos com elevada acidez volátil (Remize et al., 2000). No entanto, devido à polémica que existe na Europa sobre o uso de microrganismos geneticamente modificados para a produção de alimentos, não é possível utilizar a estirpe descrita para vinificação ou processos de desacidificação ou bio-redução (Schuller e Casal, 2005; Schuller, 2010). Alternativamente, concentrações excessivamente altas de ácido acético (superiores ao limite legal de 1,2 g/l) podem ser removidas dos vinhos por refermentação do mesmo (Processo 3) (Riberéau-Gayon et al., 1975). Neste processo, denominado de remostagem, um terço de vinho com acidez volátil elevada é misturado com dois terços de uvas recémesmagadas ou de bagaço residual obtido do final de uma 3

6 fermentação alcoólica (polpa restante, após a drenagem do vinho recém-feito). Esta abordagem empírica reduz a acidez volátil da mistura de valores próximos de 0,73 g/l de ácido acético para valores dentro de uma faixa de cerca de 0,37 g/l de ácido acético. É também um processo de baixo custo, no entanto, o risco de resultados finais inesperados e efeitos prejudiciais sobre a fermentação é bastante alto, uma vez que a diversidade de leveduras envolvidas (microbiota indígena) é, em grande parte, variável (Zoecklein et al., 1995). A imobilização de células por aprisionamento em matrizes de alginato de cálcio é uma técnica que tem recebido atenção crescente e com variadas aplicações (Ciani 1995; Silva et al, 2003). Vinhos de elevada qualidade foram já obtidos por cofermentação de células imobilizada de Candida stellata com células livres de Saccharomyces cerevisiae (Ciano e Ferraro, 1998). Foram, também, já submetidas várias patentes que visam a utilização de leveduras imobilizadas, quer em matriz de alginato de cálcio contendo uma ou várias camadas de alginato ou outro agente imobilizador (Nos documentos: US A Produção de bebidas alcoólicas por leveduras imobilizadas em esferas de alginato de cálcio ; WO A1 Método de imobilização em alginato de cálcio ; WO2004/070026A1 Produção de esferas com Kappa carrageenan para produção de cerveja em contínuo; WO2004/090128A1 Método para imobilização de microrganismos (leveduras ou bactérias) com o objectivo de os utilizar na preparação de bebidas fermentadas como vinhos tranquilos, cerveja, vinhos espumantes, bebidas gasosas e álcool etílico), quer noutros suportes físicos de aprisionamento como é o caso do 4

7 documento US2001/ A Produção de licores com leveduras imobilizadas num bio-reactor. O documento Na Patente Nrº WO2004/090128A1 descreve a utilização de uma matriz de imobilização de dupla camada alginato-alginato enquanto que na presente invenção a matriz de imobilização é uma dupla camada de alginatoquitosano. Esta diferença está também presente em relação aos outros processos de imobilização mencionados. Assim, na presente invenção utilizam-se células de Saccharomyces cerevisiae imobilizadas numa matriz de dupla camada de alginato-quitosano, para a redução da acidez volátil de mostos e vinhos. Para este efeito, a eficiência de remoção de ácido acético de mostos e vinhos contendo diferentes concentrações de ácido acético com células imobilizadas de Saccharomyces cerevisiae foi também avaliada. Verificámos que as células imobilizadas apresentam maior tolerância ao etanol, em comparação com as células livres permitindo que as células imobilizadas em dupla camada de alginato-quitosano removem mais eficientemente o ácido acético de vinhos com valores de acidez volátil de 1,1 a 1,7 g/l de ácido acético, um teor em etanol até 12,5%; e valores de ph entre 3.50 e 3,12 (Vilela-Moura et al., 2010a). Estes resultados são consistentes com trabalhos anteriores que indicam uma maior resistência das células imobilizadas ao etanol (Norton et al., 1995) e ao stress imposto pelo meio ácido (Hansen et al., 2002). Este método facilita ainda a separação das leveduras do vinho tratado após terminado o processo de bio-redução do ácido acético. A presente invenção permite uma remoção da acidez volátil mais eficiente e mais económica, constituindo uma alternativa aos outros métodos descritos e que contribui 5

8 para melhorar, significativamente, a qualidade dos vinhos com níveis excessivos de acidez volátil. Descrição Geral O excesso de ácido acético nos vinhos torna-os impróprios para consumo o que se traduz em prejuízos económicos para o produtor. Neste contexto, a remoção de ácido acético de mostos ou vinhos é um aspecto relevante para a indústria vinícola. Diversas metodologias, com o objectivo de diminuir a excessiva acidez volátil dos vinhos têm sido propostas. No entanto, o vinho resultante, geralmente, tem reduzido valor comercial o que também apresenta perdas económicas para o produtor. A imobilização de células por aprisionamento em matrizes de alginato de cálcio é uma técnica que tem recebido atenção crescente na indústria do vinho e de bebidas alcoólicas. A presente invenção descreve um processo de redução da acidez volátil excessiva de mostos e vinhos, permitindo melhorar significativamente a qualidade global dos vinhos de uma forma barata, simples e eficiente. A utilização de células de S. cerevisiae imobilizadas numa matriz de dupla camada de alginato-quitosano, reduz surpreendentemente a acidez volátil de vinhos. Para este efeito, a eficiência de remoção de ácido acético de vinhos contendo diferentes concentrações de ácido acético com células imobilizadas de Saccharomyces cerevisiae foi avaliada. Verificou-se que as células imobilizadas de levedura em dupla camada de alginato-quitosano removem eficientemente o ácido acético de vinhos com valores de acidez volátil de 1,1 a 1,7 g/l de ácido acético, teor em etanol até 12,5% e valores de ph entre 3.5 e 3,12. 6

9 Sumário Um dos objectivos da presente invenção é descrever um processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos que possa ser aplicado directamente no mosto/vinho ácido, sem a necessidade de adição de mosto ou bagaço, ou de qualquer outra fonte de açúcar. A presente invenção descreve um processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos que compreende o contacto da amostra de mosto/vinho a tratar com levedura vínicas Saccharomyces cerevisiae - imobilizadas numa matriz de dupla camada de alginato-quitosano, de preferência a matriz dupla pode apresentar-se na forma de esferas. Numa realização preferencial do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, a imobilização de leveduras vínicas pode incluir os seguintes passos: - aclimatização prévia das referidas leveduras vínicas às condições stressantes em termos de percentagem de etanol ou concentração de ácido acético ou ph; - centrifugação e re-suspensão das células numa solução aquosa de alginato de cálcio, de preferência a 2% p/v; - formação das esferas por gelificação ionotrópica com solução de alginato de cálcio, de preferência previamente refrigerada a 4ºC, onde permanecem durante 0,5-1,5 h, de preferência 1h; - transferência das esferas para uma solução de quitosano 1% (p/v) durante h de preferência 24 h a 20-25ºC com agitação orbital; - lavagem das esferas, de preferência com água destilada estéril. 7

10 Numa realização mais preferencial do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos a levedura pode estar sujeita a pelo menos um das seguintes condições stressantes: - percentagem de etanol até 15 %; - concentração de ácido acético até 2 g/l; - ph inferior a 4 ; Numa realização ainda mais preferencial do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos este deve ser efetuado por levedura(s) vínica(s) de Saccharomyces cerevisiae. Numa outra realização ainda mais preferencial do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, os valores de acidez volátil do vinho/mosto a tratar podem variar de 0,5-2 g/l, de preferência 1,1 a 1,7 g/l de ácido acético. Numa outra realização outra ainda mais preferencial do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, o teor de álcool do vinho a tratar poder atingir valores até 10-20%, de preferência 12,5%-14%. Numa outra realização outra ainda mais preferencial do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, o ph do vinho/mosto a tratar pode variar até ph 4 inclusive, de preferência de 3,12-3,54. Breve descrição das figuras Figura 1 - Imagens de microscopia electrónica de varrimento (SEM) de células de S. cerevisiae, imobilizadas em esferas de dupla camada de alginato-quitosano: I) Esfera com 8

11 alginato 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) (140x); II) Esfera com alginato 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) (1000X); III) Esfera com alginato de 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) (5000X); IV) Distribuição de células no interior da esfera com alginato de 2% (p/v) e quitosano 1,0% (w/v), após desacidificação de um vinho a ph 3,12 (10000x); V) Camada externa de uma esfera após desacidificação de um vinho a ph 3,12 (5000X); VI) Camada externa de uma esfera após desacidificação de um vinho a ph 3,5 (4000X). Descrição detalhada da invenção A presente invenção diz assim respeito a um uso inovador para um processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, utilizando estirpes de leveduras comerciais, imobilizadas em esferas de dupla camada de alginatoquitosano, como prática enológica para corrigir os mostos ou vinhos com excessiva acidez volátil. Esta nova utilização fornece uma base eficiente e barata de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, uma alternativa aos métodos actualmente disponíveis e que contribui para melhorar, significativamente, a qualidade dos vinhos com níveis excessivos de acidez volátil. O processo descrito pode ser aplicado directamente no vinho ácido, sem necessidade de adição de mosto ou bagaço, ou de qualquer outra fonte de açúcar. Numa abordagem de pesquisa de leveduras mais adequadas para um processo de desacidificação biológica de vinhos com acidez volátil elevada, 135 isolados e nove estirpes de Saccharomyces cerevisiae comerciais foram caracterizadas quanto à sua capacidade de utilização simultânea da glucose e do ácido acético. 9

12 As estirpes mais promissoras foram avaliadas em meio sintético contendo vinhos com acidez volátil elevada que foram suplementados com alta concentração de glucose/baixa concentração em etanol ou baixa concentração em glucose/alta concentração em etanol. Pretendia-se desta forma simular a refermentação de um vinho com uvas do início da uma fermentação alcoólica ou com o bagaço residual de um vinho acabado, respectivamente. As leveduras testadas removeram mais de 80% do ácido acético do meio em condições laboratoriais e removeram entre 40 a 50% do ácido acético em mostos-vinho brancos e mais de de 50-70% do ácido acético mostos-vinho tintos à escala piloto. A capacidade de redução da acidez volátil de mostos e vinhos foi também avaliada em condições muito stressantes impostas pela combinação de etanol, ácido acético e SO 2. As leveduras S. cerevisiae testadas reduziram eficientemente a acidez volátil (entre 80% e 50%) de vinhos ácidos, sem a adição de qualquer fonte de açúcar (mosto ou bagaço) com concentrações iniciais de ácido acético até 1,0 g/l e concentrações de etanol não superiores a 11% (v/v). No entanto, o poder anti-oxidante e efeito anti-séptico de dióxido de enxofre (SO 2 ) em concentrações de mg/l inibiu a redução da acidez volátil. A redução da acidez volátil induziu a formação de compostos aromáticos no vinho, tais como acetato de isoamilo (aroma a banana) hexanoato de etilo (aromas a maçã e ou abacaxi), entre outros. Para aumentar a eficiência do processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos utilizámos a levedura imobilizada. Verificou-se que a imobilização das células (8,0 x10 7 células/ml) em dupla camada de alginato/quitosano (2:1 p/v) resultou na redução de 40-45% do ácido acético ao fim de 72 horas num vinho com uma acidez volátil inicial de 10

13 1,1 g/l, um teor alcoólico de 12,5% (v/v) e um valor de ph de 3, x 107 cel/ml 8.0 x 107 cel/ml Vinhos 48h 72h 48h 72h Glucose % Ácido acético % CFU ml -1 Glucose % Ácido acético % CFU ml -1 Glucose % Ácido acético % CFU ml -1 Glucose % Ácido acético % CFU ml -1 Vinho(A) Açúcar residual 1.12 g/l Ácido acético 17.9 ± ± ± ± g/l Etanol 12.5% (v/v) 4.4x103 ± 1.4x102* 3.5x104 ± 7.1x102* 5.6x103 ± 2.8x102* 6.7x104 ±1.4x103* ph 3.50 Vinho(B) Açúcar residual 1.12 g/l Ácido acético 24.8 ± ± ± ± g/l Etanol 12.5% (0.0 ± 0.0) (0.0 ± 0.0) (0.0 ± 0.0) (0.0 ± 0.0) (v/v) ph 3.12 Vinho (C) Açúcar residual 1.12 g/l Ácido acético 26.4 ± ± g/l Etanol 12.5% (0.0 ± 0.0) (0.0 ± 0.0) (v/v) ph

14 Vinho (D) Açúcar residual 1.12 g/l Ácido acético 1.5 g/l Etanol 12.5% (v/v) ph ± 0.1 (0.0 ± 0.0) 32.7 ± 4.4 (0.0 ± 0.0) Vinho(E) Açúcar residual 1.12 g/l 21.7 ± ± 0.8 Ácido acético 1.7 g/l (0.0 ± 0.0) (0.0 ± 0.0) Etanol 12.5% (v/v) ph 3.12 * Ocorrência de floculação das células. Tabela 1 - Consumo percentual de glucose e de ácido acético (%) e número de células no vinho (CFU/mL) após 48 e 72 horas de redução da acidez volátil de mostos e vinhos por Saccharomyces cerevisiae imobilizada em dupla camada de alginato-quitosano (2:1%, p/v) para duas concentrações celulares no alginato (4.0 x 10 7 e 8.0x10 7 células/ml). Os ensaios foram realizados em condições de aerobiose-limitada (230 ml de vinho colocado em frascos erlenmeyer de 250 ml de capacidade, devidamente tapados) à temperatura de 25ºC. A percentagem de remoção está dependente da concentração celular (concentração de células na matriz de alginatoquitosano - Tabela 1) e para a mesma concentração celular - 8,0 x10 7 células/ml - também está dependente do valor de ácido acético inicial do vinho. Assim, para um valor inicial de 1,3 g/l verificou-se uma percentagem de remoção de 30-40%; para um valor de 1,5 g/l 25-40% e para um 12

15 valor de ácido acético inicial de 1,7 g/l verificou-se uma percentagem de remoção de 25-35% (Tabela 1). A integridade das esferas depende do ph do meio, tendo-se verificado que a ph 3,5 ocorria libertação de células para o exterior (Tabela 1), isto é, a membrana externa de quitosano perdia alguma integridade. No entanto, as células floculavam, o que permitia o seu rápido depósito no fundo do reactor (frasco erlenmeyer) mantendo-se, o vinho, com um aspecto límpido. Para avaliação da integridade das esferas de dupla camada de alginato-quitosano com uma concentração celular de 8.0x10 7 células/ml, antes e após o processo de desacidificação, procedeu-se ao seu estudo por microscopia electrónica de varrimento (SEM). A análise foi realizada num microscópio eletrónico de varrimento Philips-FEI/Quanta 400. Verificou-se que as esferas tinham uma forma elipsoidal e um diâmetro médio de 1,0-2,0 mm (Figura 1 - I), forma e tamanho semelhantes ao relatado por outros autores (Briggs et al., 2004). As esferas mostraram ainda uma superfície bastante homogénea (Figura 1 - II). Alguns poros extrusivos, com um diâmetro médio de 5 µm, aparecem na camada externa de quitosano, provavelmente devido à libertação de gás durante o processo de formação das esferas (Figura 1 - II e III). As células mostram-se regularmente distribuídas pela camada interna de alginato, após a sua utilização (processo de desacidificação) (Figura 1 - IV). Após 168 horas de desacidificação num vinho a ph 3,5, a camada externa de quitosano perde alguma integridade (Figura 1 - VI), enquanto a um valor de ph mais baixo - 3,12, a integridade da camada externa foi mantida (Figura 1 - V). 13

16 A utilização de leveduras imobilizadas em alginatoquitosano permite aumentar a tolerância ao ácido acético, ao etanol e a valores de ph mais baixos. Apresenta ainda a vantagem de permitir uma rápida separação da levedura do vinho, após o processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos, obtendo-se no final um vinho limpo, sem turvação. Apresentam-se de seguida algumas realizações preferenciais da invenção não sendo contudo restritivas do seu âmbito de protecção. Exemplo 1 Redução da acidez volátil de um vinho com uma acidez volátil de 1,1 g/l de ácido acético, 12.5% (v/v) de etanol e ph A levedura S. cerevisiae utilizada foi mantida a -80 ºC em tubos de crio-preservação contendo caldo de YPD (glicose 2% p/v, peptona 1% p/v e extrato de levedura 0,5% p/v) suplementado com glicerol (30% v/v). Antes de cada utilização, a estirpe foi semeada em placas de YPD (glicose 2% p/v, peptona 1% p/v, extrato de levedura 0,5% p/v e agar 2% p/v) e incubada durante 48 horas a 25 ºC. A seguir, uma pré-cultura foi cultivada durante 12 horas em 100 ml do vinho com elevada acidez volátil a 25 ºC e 120 rpm. Este procedimento permitiu uma aclimatização das células ao meio, neste caso o vinho ácido, onde iriam ser posteriormente incubadas após imobilização. Em alternativa, as células podem ser incubadas em meio mineral mínimo (van Uden, 1962) com um teor de etanol, ácido acético e ph semelhante ao do vinho a testar. 14

17 As células foram centrifugadas (5500 rpm a 4 ºC durante 10 min.) e re-suspendidas numa solução aquosa de alginato de cálcio a (2%, p/v - Sigma Aldrich, ref.71238, preferencialmente). Foi utilizada uma concentração celular de 8.0x107 células/ml na solução de alginato. O alginato, com a suspensão de células, foi colocado numa seringa de plástico de 10 ml e gotejado, a uma altura de 10 cm, para dentro de um frasco com 300 ml de uma solução de CaCl2 (0.18M -.Sigma Aldrich, ref C1016, preferencialmente) previamente esterilizada por filtração (Millipore 0,22 µm de tamanho de poro, preferencialmente) e refrigerada a 4 ºC. As pequenas gotas, à medida que caiam eram mantidas em suspensão na solução de CaCl 2 por agitação magnética (100 rpm). As esferas formadas (gotas obtidas por gelificação ionotrópica do alginato com o cálcio) permaneceram na solução de CaCl 2 por uma hora (4 ºC) e foram seguidamente transferidos para um Erlenmeyer (1000 ml) com 250 ml de quitosano de baixo peso molecular (1%, p/v - Sigma Aldrich, ref , preferencialmente) onde foram incubadas durante 24 horas a 25 ºC com agitação orbital (100 rpm). Finalmente, as esferas foram lavadas duas vezes com água destilada estéril e transferidas para balões erlenmeyer de 250 ml, utilizando cerca de 100 esferas para 230 ml de vinho com acidez volátil elevada a testar. Os balões erlenmeyer foram colocados numa câmara de crescimento, a 25 ºC, com agitação (100 rpm). Durante o processo de de redução da acidez volátil de mostos e vinhos foi necessário retirar amostras de 24 em 24 horas para monitorização do teor em ácido acético, etanol (utilizando-se testes (kits) enzimáticos - Enzytec, SCIL Diagnostics, Viernheim, Alemanha, preferencialmente) e número de células no meio (monitorização da integridade das 15

18 esferas) por espalhamento de 100 µl da amostra (vinho) em meio de cultura YPD (descrito anteriormente). Resultados: Ao fim de 48, 72 e 168 horas verificou-se que o decréscimo da acidez volátil era de 31.1±3.4%, 42.9±2.4% e 61.8±0.9%, respectivamente. O vinho final (às 168 horas) apresentava um teor alcoólico de 11,8% (v/v), tendo-se verificado, portanto, uma diminuição de 0,7% (v/v) em etanol. Verificou-se um acentuado decréscimo na acidez volátil, de 1,1 g/l (valor inicial) para 0,42 g/l (valor final, às 168 horas) Vinho não Vinho após o Métodos analíticos Característica tratado tratamento utilizados (CEE N.º química (1) 2676/90)* SO2 livre (mg/l) 4,8 0.0±0.0 Método de Ripper SO2 total (mg/l) 70,5 71,05±3,44 Método de Ripper Acidez volátil 1,1 0,42±0,1 Destilação com o (g/l de ácido Cazenave-Ferré seguida acético) de titulação com fenolftaleína Açúcar residual 1,12 Método de Lane-Eynon (g/l) Acidez total 5,55 5,10±0,00 Titulação com azul de (g/l ácido bromotimol tartárico) ph 3,12 2,95±0,05 Potencimétrico Grau alcoólico 12,5 11,8±0,1 Destilação %,etanol (v/v) * CEE N.º 2676/90 Jornal oficial das Comunidades Europeias, 33, (ISSN ) (1)- Os valores apresentados são a média de 3 ensaios por vinho. 16

19 Tabela 2 - Características do vinho do Exemplo 1, antes e após 168 horas (7 dias) de processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos. Não ocorreu libertação de células durante o processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos. Exemplo 2 Redução da acidez volátil de um vinho com uma acidez volátil de 1,5 g/l de ácido acético, 12.5% (v/v) de etanol e ph Todos os procedimentos utilizados foram semelhantes aos descritos no Exemplo 1, que serve como exemplo para qualquer tipo de vinho. Resultados: Ao fim de 48, 72 e 168 horas verificou-se que o decréscimo da acidez volátil era de 25.9±0.1 %, 32.7±4.4 % e 50.0±4.0 %, respectivamente. O vinho final (às 168 horas) apresentava um teor alcoólico de 11,3% (v/v), tendo-se verificado, portanto, uma diminuição de 1,2% (v/v) em etanol. Verificou-se um acentuado decréscimo na acidez volátil, de 1,5 g/l (valor inicial) para 0,75 g/l (valor final, às 168 horas). Vinho antes Vinho após o Métodos analíticos Característica do tratamento (1) utilizados (CEE N.º química tratamento 2676/90)* SO2 livre (mg/l) 4,8 0.0±0.0 Método de Ripper SO2 total (mg/l) 70,5 75,56±1.41 Método de Ripper Acidez volátil 1,5 0,75±0,1 Destilação com o 17

20 (g/l de ácido acético) Açúcar residual (g/l) Acidez total (g/l ácido tartárico) Cazenave-Ferré seguida de titulação com fenolftaleína 1,12 Método de Lane-Eynon 5,55 6,32±0,03 Titulação com azul de bromotimol ph 3,15 2,63±0,01 Potencimétrico Grau alcoólico 12,5 11,3± 0,1 Destilação %,etanol (v/v) * CEE N.º 2676/90 Jornal oficial das Comunidades Europeias, 33, (ISSN ) (1)- Os valores apresentados são a média de 3 repetições para cada vinho testado. Tabela 3 - Características do vinho do Exemplo 2, antes e após 168 horas (7 dias) de processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos Não ocorreu libertação de células durante o processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos. A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral da invenção, tal como definido nas reivindicações. As realizações acima descritas são todas combinadas entre si de forma trivial. 18

21 As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção. Lisboa, 12 de Abril de

22 4. Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por, a levedura estar sujeita a pelo menos um das seguintes condições stressantes: a. percentagem de etanol até 15 %; b. concentração de ácido acético até 2 g/l; c. ph inferior a Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado pela redução da acidez volátil de mostos e vinhos ser efetuada por leveduras vínicas de Saccharomyces cerevisiae. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por, os valores de acidez volátil do vinho/mosto de vinho a tratar, variarem de 0,5-2 g/l, de preferência de 1,1 a 1,7 g/l de ácido acético. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por, o teor de álcool do vinho/mosto de vinho a tratar poder atingir valores até 10-20%, de preferência 12,5%-14%. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o ph do vinho/mosto de uva a tratar variar até 4 inclusive, de preferência de 3,12-3,54. Lisboa, 12 de Abril de

23 R E I V I N D I C A Ç Õ E S 1. Processo de redução da acidez volátil de mostos e vinhos é caracterizado por colocar em contacto a amostra de mostos/vinhos a tratar com levedura vínicas Saccharomyces cerevisiae - imobilizadas numa matriz de dupla camada de alginato-quitosano. 2. Processo de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por a referida matriz dupla ser na forma de esferas. 3. Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por, a imobilização de leveduras vínicas na matriz de dupla camada estar compreendida pelos seguintes passos: a. aclimatização prévia das referidas leveduras vínicas às condições stressantes da desacidificação em termos de percentagem de etanol ou concentração de ácido acético ou ph; b. centrifugação e re-suspensão das células numa solução aquosa de alginato de cálcio, de preferência a 2% p/v; c. formação das esferas por gelificação ionotrópica com solução de alginato de cálcio, de preferencia previamente refrigerada a 4ºC, onde permanecem durante 0,5-1,5 h, de preferência 1h; d. transferência das esferas para uma solução de quitosano 1% (p/v) durante h de preferência 24 h a 20-25ºC com agitação orbital; e. lavagem das esferas. 1