LUIZ CARLOS BASSO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ESALQ/USP. V SEMANA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, Piracicaba 19/

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1 A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA: ALGUNS ASPECTOS BIOQUÍMICOS, FISIOLÓGICOS E MICROBIOLÓGICOS LUIZ CARLOS BASSO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ESALQ/USP V SEMANA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, Piracicaba 19/

2 CONTEÚDO DA APRESENTAÇÃO O PROCESSO INDUSTRIAL E OS ESTRESSES IMPOSTOS À LEVEDURA SELEÇÃO DE LEVEDURAS E SEU BENEFÍCIO PARA A FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO BACTERIANA: ALTERNATIVAS RELACIONADAS COM AS LEVEDURAS A DIVERSIDADE DOS LACTOBACILLUS E ESTRATÉGIA PARA O CONTROLE DAS BACTÉRIAS CONSIDERAÇÕES FINAIS

3 A SINGULARIDADE DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA AÇUCAR CARBONO CÉLULA FILHA ETANOL CO 2 LEVEDURA

4 PORQUE A LEVEDURA TRANSFORMA O AÇÚCAR EM ETANOL? AÇUCAR (100g) ATP CARBONO BIOMASSA (5%) ETANOL+ CO 2 = 90% OUTROS = 5%

5 A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA + HEXOSE FRUTOSE GLICOSE P NH + 4 Mg ++ TREALOSE E GLICOGÊNIO BIOMASSA K + PROTEINAS SACAROSE GLICEROL ATP K + PIRUVATO AMINOÁCIDOS Zn ++ NH 4 + CO 2 AC.ORGÂNICOS AC.ORGÂNICOS : SUCCÍNICO, MÁLICO, PIRÚVICO ETANOL ETANOL

6 O PROCESSO FERMENTATIVO COM RECICLO DE CÉLULAS ÁCIDO MOSTO ph= horas CUBA o C 6-10 horas 7-14% cels DORNA Pé de cuba CENTRÍFUGA CREME VINHO ph= %EtOH

7 O coração da fermentação: a dorna Açúcar da cana 5 10 µ ETANOL LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae

8 CONTAMINANTES DA FERMENTAÇÃO Açúcar da cana ETANOL LEVEDURA + BACTÉRIA

9 O SUBSTRATO: CALDO DE CANA E MELAÇO CANA EXTRAÇÃO CALDO (16-20% AT) AGUA BAGAÇO CONCENTRAÇÃO (EVAPORAÇÃO) SUBSTRATO (18-20%AT) SACAROSE (CRISTAIS) MELAÇO (50-60% AT)

10 FATORES LIMITANTES DA PRODUTIVIDADE Alta densidade de células (10-14%) : deficiências minerais-n,p,mg,mn,zn Fermentação rápida (6-10 h) Pressão osmótica (sais, açúcar) Etanol (7-11%) Acidez (ph= ) Temperatura (32-40 o C) Contaminação bacteriana Sulfito, Alumínio, excesso K, Ca, etc

11 FATORES ESTRESSANTES TEMPERATURA ETANOL PRESSÃO OSMÓTICA K +, Ca ++ AÇÚCAR DESN.PROTEINAS ÁGUA H 2 SO 3 HSO 3 - SULFITO = S0 2 H + GLICEROL ATP H + AC. ORGÂNICOS ADP ADP CH 3 COOH H + ATP-Al 2 H + + SO 4-2 COOH COO - CH 3 COO - ATP-Mg CHOH CH3 CHOH CH3 + H + CONT. BACTERIANA = ACIDOS.ACÉTICO E LÁTICO Al +3 H 2 SO 4

12 A ESTEQUIOMETRIA DA FERMENTAÇÃO Açúcar da cana 1% NO RENDIMENTO EM ALCOOL TEM GRANDE IMPACTO NO LUCRO! ETANOL E CO 2 : 80-90% DO AÇÚCAR BIOMASSA GLICEROL ÁCIDOS ORGÂNICOS OUTROS SUBPRODUTOS AÇÚCAR RESIDUAL 10-20%

13 BALANÇO DE MASSA (EM ANAEROBIOSE) PRODUTOS DA FERMENTAÇÃO ETANOL GÁS CARBÔNICO BIOMASSA GLICEROL AC. SUCCÍNICO AC. ACÉTICO ÓLEO FUSEL OUTROS OUTROS SUBPRODUTOS Para um consumo total do açúcar pela levedura % DO ART CONSUMIDO ,3-1,2 0,1-0,7 0,1-0,4 < 0,1

14 GANHOS EM PRODUTIVIDADE VARIEDADES DE CANA E MELHORES PRÁTICAS AGRÍCOLAS MELHOR ENGENHARIA DO PROCESSO MELHOR ASSEPSIA NUTRIÇÃO DA LEVEDURA LINHAGENS DE LEVEDURAS

15 LINHAGENS TRADICIONALMENTE EMPREGADAS (1987) IZ-1904 TA (M300-A) PANIFICAÇÃO HAVERIA NECESSIDADE DE NOVAS LINHAGENS????

16 LEVEDURAS INDUSTRIAIS 1987: 1ª avaliação com reciclos PARÂMETROS AVALIADOS 17% 7-8%EtOH ART A C PAN/TA FL IZ % ART A 33 0 C FL PE-2 (%) 1 REND. ETANOL (%) 1 88,8 90,0 89,5 COERÊNCIA 93,2 (%) 1 GLICEROL (%) 1 4,6 5,1 5,7 3,7 TAXA CRESCIMENTO CRESCIM. (%) (%) 3 VIABILIDADE (%) SOBREVIVERIA AO ESTRESSE (%) 3 GLICOGÊNIO (%) INDUSTRIAL? 9 16 (%) 3 TREALOSE (%) Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol 2 Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos 3 Valores referentes à levedura do 6 0 ciclo fermentativo

17 LEVEDURAS INDUSTRIAIS 1987: 1ª avaliação com reciclos PARÂMETROS AVALIADOS 17% 7-8%EtOH ART A C PAN/TA FL IZ % ART A 33 0 C FL PE-2 (%) 1 REND. ETANOL (%) 1 88,8 90,0 89,5 COERÊNCIA 93,2 (%) 1 GLICEROL (%) 1 4,6 5,1 5,7 3,7 TAXA CRESCIMENTO CRESCIM. (%) (%) 3 VIABILIDADE (%) SOBREVIVERIA AO ESTRESSE (%) 3 GLICOGÊNIO (%) INDUSTRIAL? 9 16 (%) 3 TREALOSE (%) Fração do açúcar metabolizado transformado em etanol ou glicerol 2 Taxa de crescimento da levedura no transcorrer de 6 ciclos 3 Valores referentes à levedura do 6 0 ciclo fermentativo

18 A CARIOTIPAGEM E A QUEBRA DE UM PARADIGMA (1989) Colonias individuais DNA intacto Eletroforese - + TA VR2 VR1 CR PE SA BG MA4 ME3 ME1 IZ

19 SURPRESAS INICIAIS PERMANÊNCIA DAS LINHAGENS NO PROCESSO LEVEDURAS / SAFRA (DESTIL.) SAFRA 91/92 (3) DIAS DE PROCESSO SAFRA 92/93 (6) SAFRA 93/94 (9) PAN TA NF (Canadá) JA-1 - >150 >100 JA-1 Colônia isolada no final da safras anteriores pela propria destilaria (Jardest)!

20 AVALIAÇÃO DE LINHAGENS ISOLADAS DE PROCESSO 1993 PARÂMETRO* TA JA-1 SA-1 RENDIMENTO(%) 86,8 87,3 88,0 GLICEROL(%ART) 4,49 3,98 3,71 TAXA CRESC.(%) VIABILIDADE FINAL(%) CICLOS FERMENTATIVOS

21 IMPLANTAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS SAFRA 94/95 25 DESTILARIAS LEVEDURA (N o DEST.) TAXA PERMA- NÊNCIA (%) TAXA DOMI- NÂNCIA (%) SA-1 (20) CR-1 (20) JA-1 (20) FL/IT (5)

22 GRANDE BIODIVERSIDADE (SUCESSÃO DE DIFERENTES LINHAGENS) DEST. A 27/07/04

23 STRAINS DOMINANTES E PERSISTENTES DESTILARIA B 31/08/04 DOMINÂNCIA = COMPETITIVIDADE PERSISTÊNCIA = MÚLTIPLA TOLERÂNCIA

24 O PROCESSO INDUSTRIAL COMO FONTE DE LINHAGENS APROPRIADAS GRANDE BIODIVERSIDADE LINHAGENS PERSISTENTES (TOLERANTES?) LINHAGENS DOMINANTES (COMPETITIVAS?) POUCAS LINHAGENS DOMINANTES E PERSISTENTES PRESSÃO SELETIVA DO PROCESSO COM RECICLO DE CÉLULAS 2 CICLOS/DIA DIAS SELEÇÃO OU ADAPTAÇÃO EVOLUTIVA LEVANDO A LINHAGENS COM TOLERÂNCIA A VÁRIOS TIPOS DE ESTRESSE, MESMO DESCONHECIDOS RESISTENTES, MAS NÃO NECESSARIAMENTE COM BONS ATRIBUTOS FERMENTATIVOS

25 A MAIORIA DAS LINHAGENS SÃO IMPRÓPRIAS PARA A FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL 15% ESPUMA FLOCULAÇÃO 85% SOBRA DE ART COM PROBLEMAS SEM PROBLEMAS

26 PRIMEIRO PASSO: ESPUMA, FLOCULAÇÃO E AÇÚCAR RESIDUAL SUSPENSÃO HOMOGENEA ESPUMA ESPUMA E FLOCULAÇÃO AÇÚCAR RESIDUAL

27 SEGUNDO PASSO: DESEMPENHO FERMENTATIVO Rendimento em etanol Produção de glicerol Taxa de crescimento Velocidade de fermentação Manutenção de alta viabilidade durante reciclos (altos conteúdos celulares de glicogênio e trealose) FERMENTAÇÕES COM RECICLO SIMULANDO O PROCESSO INDUSTRIAL

28 DESEMPENHO FERMENTATIVO PARÂMETROS FERMENTATIVOS PANIFIC. PE-2 RENDIMENTO EM ETANOL (%) GLICEROL (%) TAXA DE CRESCIMENTO (%) VIABILIDADE (%) GLYCOGENIO CELULAR (%MS) 9 16 TREALOSE CELULAR (%MS) CICLOS FERMENTATIVOS A 33 o C, 9% ETANOL SA-1

29 3 o PASSO: REINTRODUÇÃO NO PROCESSO INDUSTRIAL PROPAGAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS INTRODUÇÃO EM VÁRIAS DESTILARIAS (EM ATÉ 70 EM 11 ANOS/SAFRAS) MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM (AMOSTRAS MENSAIS) CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO PERSISTÊNCIA DOMINÂNCIA

30 REINTRODUÇÃO NO PROCESSO INDUSTRIAL LINHAGENS INTRODUZIDAS KG (DESTILARIA A SAFRA 95) PANIFICAÇÃO PE-2 0,5 VR-1 0,5 SA-1 0,5

31 MONITORAMENTO PELA CARIOTIPAGEM DINÂMICA POPULACIONAL 100% PROPORÇÃO 80% 60% 40% 20% 0% DIAS PAN PE-2 SA VR-1

32 CAPACIDADE DE IMPLANTAÇÃO MONITORAMENTO EM DESTILARIAS DURANTE 11 ANOS ( ) LINHAGEM INTRODUZIDA DESTILARIAS COM A LINHAGEM (%) PROPORÇÃO DA LINHAGEM (%) PE BG CAT SA VR CR OTHERS* 0 0 * PANIFIC., VINHO, CERVEJARIA, Y-904, IZ-1904, TA, NF, M-26, ETC. 40% DAS DESTILARIAS OPERAM COM LINHAGENS INDÍGENAS!

33 BENEFICIOS DAS LEVEDURAS SELECIONADAS MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS MENOR FLOCULAÇÃO

34 A SELEÇÃO PODERIA SER DIRECIONADA TAMBÉM PARA A REDUÇÃO DA CONTAMINAÇAO BACTERIANA? MAIOR RENDIMENTO EM ETANOL MENOR FORMAÇÃO DE ESPUMAS MENOR FLOCULAÇÃO AÇÃO ANTIBACTERIANA?

35 LEVEDURAS COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA QUE ATRIBUTOS PODERIAM SER CONSIDERADOS? Produzir algum inibidor? Reduzir os alimentos requeridos pela bactéria? Leveduras geneticamente modificadas (lisozima, nisina, pediocina...) Etc...

36 RELAÇÕES TRÓFICAS ENTRE LEVEDURAS E BACTÉRIAS REDUÇÃO DO RENDIMENTO EM ETANOL -METABÓLITOS BACTERIANOS -BIOMASSA BACTERIANA -MAIOR PRODUÇÃO DE GLICEROL PELA LEVEDURA REDUÇÃO DA VIABILIDADADE DA LEVEDURA FLOCULAÇÃO ESPUMA

37 Antagonismo entre leveduras e bactérias Ácidos lático e acético bactéria ácido succínico COOH C 6 H 12 O 6 CH 2 levedura CH 2 5 GLICEROL 10 H e - 1 COOH 2 + CO 2

38 ÁCIDO SUCCÍNICO X CONTAMINAÇÃO BACTERIANA CONTAMINAÇAO 60 (cel/ml x 10>6) Cherubin (2003) CICLOS M-26 PE-2 Oliva Neto (2006) M-26: 46% a mais que PE-2

39 QUAIS SERIAM OS SUBSTRATOS PARA AS BACTÉRIAS? CINETICA FERMENTAÇAO (4 HORAS DE ALIMENTAÇAO) HORAS GLIC FRUT SAC ETANOL 0

40 A ATIVIDADE DA INVERTASE É MAIOR QUE A VELOCIDADE DE ABSORÇÃO DA GLICOSE E FRUTOSE PELA LEVEDURA O H 2 O INVERTASE + GLICOSE FRUTOSE SACAROSE Não é absorvida pela levedura Açúcares absorvidos pela levedura com preferencia pela glicose

41 Lactobacilos: tipos de metabolismo Homo-fermentativa Hetero-fermentativa Açúcares Açúcares Ácido Lático Ácido Lático Gallo, 1989; Costa et al. (2008) Ácido Acético Manitol CO 2 Etanol

42 onsumo de glicose e frutose por Lactobacilos isolados de destilarias A bactéria hetero-fermentativa tem preferência pela frutose Homo-fermentativo Hetero-fermentativo Glicose Frutose Glicose Frutose 1,00 1,00 0,80 0,80 Açúcares (%) 0,60 0,40 Açúcares (%) 0,60 0,40 0,20 0,20 0, , tempo (horas) tempo (horas)

43 A FERMENTAÇÃO FAVORECE O CRESCIMENTO DO TIPO HETEROFERMENTATIVO CINETICA FERMENTAÇAO (4 HORAS DE ALIMENTAÇAO) X mais frutose HORAS GLIC FRUT SAC ETANOL 0

44 Fermentação contaminada com bactérias homo- e heterofermentativa BACTERIAS 50 (Cel/mL x 10e7) CICLOS S/ BACT HOMO HETERO

45 Poucas diferenças nos níveis de acido lático ACIDO LATICO 4000 (mg/l) CICLOS S/ BACT HOMO HETERO

46 A bactéria hetero-fermentativa produz mais ácido acético ACIDO ACETICO 1800 (mg/l) CICLOS S/ BACT HOMO HETERO

47 A bactéria hetero-fermentativa afeta mais a viabilidade da levedura VIABILIDADE 100 (%) CICLOS S/ BACT HOMO HETERO

48 Somente a bactéria hetero-fermentativa produz manitol MANITOL 2000 (mg/l) CICLOS S/ BACT HOMO HETERO

49 Apenas a bactéria hetero-fermentativa induz maior formação de glicerol GLICEROL 0,6 (%) 0,5 0,4 0,3 0, CICLOS S/ BACT HOMO HETERO

50 A bactéria hetero-fermentativa afeta mais o rendimento RENDIMENTO 92 (%) CICLOS S/ BACT HOMO HETERO Haveria necessidade de combater todos os tipos de lactobacilos? Como avaliar os antibacterianos (homo- e hetero)?

51 PODEMOS REDUZIR O CRESCIMENTO BACTERIANO? REDUZINDO OS ALIMENTOS PARA AS BACTÉRIAS: AÇÚCARES AMINOÁCIDOS E VITAMINAS (MOSTO E LEVEDURAS MORTAS)

52 A CONTAMINAÇÃO BACTERIANA SELEÇÃO DE LEVEDURAS PARA METABOLIZAÇÃO MAIS RÁPIDA DOS AÇÚCARES

53 Considerações finais As leveduras selecionadas colaboram para reduzir os custos de produção do etanol Novas e mais apropriadas linhagens ainda podem ser selecionadas a partir da biodiversidade encontrada nas destilarias (processos diferentes, diferentes linhagens) Os lactobacilus hetero-fermentativos se mostram mais perniciosos para a fermentação em relação aos do tipo homo-fermentativo Novas linhagens com características antibacterianas poderão ser isoladas (baixos teores de açúcar durante a fermentação)

54 OBRIGADO PELA ATENÇÃO! LUIZ CARLOS BASSO

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