Determinação da concentração das proteínas plasmáticas (proteinémia)

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1 Determinação da concentração das proteínas plasmáticas (proteinémia) Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Bioquímica I 1.º Ano do Mestrado Integrado de Medicina Turma 6 Ano lectivo 2010/2011

2 Sumário Nesta actividade experimental pretende-se determinar a quantidade de proteína no soro plasmático. Para o efeito procedeu-se à espectrofotometria de uma amostra de soro, tendo-se traçado primeiramente uma curva padrão.

3 Objectivos Aprofundar os conhecimentos sobre compostos proteicos; Determinar a proteinémia de uma amostra; Compreender de que forma a proteinémia nos permite identificar diversas patologias.

4 Introdução As proteínas são polímeros de L-aminoácidos, unidos entre si por ligações peptídicas (planar e rígida). Todos os peptídeos possuem um grupo NH 2 e um grupo COOH terminais; são estes dois grupos moleculares, consoante estejam ou não livres, os responsáveis pelo comportamento ácido-base das proteínas. Cadeia lateral - define as características de cada aminoácido (de acordo com ph)

5 Introdução Com base na interacção dos grupos R com a água(ph=7) existem aminoácidos: Apolares; Polares Com carga Positiva Negativa Sem carga

6 Introdução A forma iónica dos aminoácidos pode ser influenciada pelo ph; PI: ph exacto ao qual determinado aminoácido tem carga nula e existe na sua forma de zwitterião (ião híbrido, com duas cargas opostas); A carga eléctrica a um determinado ph permite a separação de aminoácidos por electroforese ou por cromatografia de troca iónica; A cadeia polipeptídica tem uma determinada direcção: o grupo amina terminal localiza-se à esquerda e grupo carboxilo terminal à direita.

7 Introdução Estrutura das proteínas - primária - secundária (hélice alfa ou folhas beta) - terciária - quaternária Classificação das proteínas - Holoproteínas - Heteroproteínas

8 Introdução Funções das proteínas - Catálise enzimática - Transporte e armazenamento - Movimento - Suporte mecânico - Respostas imunológicas - Geração e transmissão do impulso nervoso - Controlo do crescimento e diferenciação - Manutenção da pressão osmótica - Tampões

9 Introdução PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Proteínas simples : Albumina É a proteína plasmática mais abundante. Tem como principais funções: 1. Manutenção da pressão osmótica 2. Transporte de substâncias (ex. hormonas, cálcio, drogas) Glicoproteínas: maior parte (ex. imunoglobulinas) Lipoproteínas: intervêm no transporte de lípidos.

10 Introdução PROTEÍNAS PLASMÁTICAS Concentração de proteínas plasmáticas (g/100ml) Albumina 4,0-5,2 Globulinas 1,9-2,7 Globulina α1 0,2 0,4 Globulina α2 0,4 0,7 Globulina β 0,7 0,9 Globulina γ 0,7 1,4 Relação 2:1 entre albumina e globulinas Proteinémia normal: g/l

11 Introdução CORRELAÇÕES CLÍNICAS Hiperproteinémia 1. A relação albumina/ globulina é normal: hemoconcentração A relação albumina/ globulina é anormal: a) aumento de albumina erro técnico b) aumento das globulinas: - Síndromes infecciosos - Mieloma múltiplo - Macroglobulinémia de Waldenström

12 Introdução CORRELAÇÕES CLÍNICAS Hipoproteinémia - Perdas renais: síndrome nefrótico - Processos neoplásicos - Processos de absorção deficiente - Defeito de síntese: insuficiência hepatocelular das doenças crónicas - Gastroenteropatias exsudativas

13 Introdução CORRELAÇÕES CLÍNICAS Hipoalbuminémia 1. Diminuição de síntese (Nutrição deficiente, Absorção deficiente, Doenças hepáticas) 2. Aumento do volume de distribuição (Hiperhidratação, Aumento da permeabilidade capilar, Hipoxémia, Septicémia) 3. Aumento da excreção ou degradação (Síndrome nefrótico, Enteropatias com perda de proteínas, Queimaduras, Hemorragias, Estados de aumento do catabolismo (sepsis, febre, doenças malignas).

14 Introdução Determinação das concentração de proteínas plasmáticas A concentração de proteínas é determinada a partir da densidade óptica (DO) da solução a um determinado comprimento de onda(λ) ao qual apresentam o máximo de absorção. A banda de absorção das proteínas encontra-se nos 280nm (ultravioleta) devido à presença de aminoácidos aromáticos (Tyr, Trp, Phe). Utiliza-se o espectrofotómetro de luz visível, logo é necessário corar as proteínas. Para tal, o reagente mais utilizado é o Biureto. O cobre do Biureto reage com a cadeia peptídica (no mínimo 2 ligações peptidicas), e ocorre a formação de um complexo de cor violeta, que permite identificar a presença do Biureto numa amostra, por espectrofotometria a λ max 540 nm.

15 Introdução Determinação das concentração de proteínas membranares Para libertar as proteínas dos lípidos que constituem as membranas DETERGENTE desnatura as proteínas separa os constituintes das membranas Interacção mais eficaz com o reagente de detecção, e consequente obtenção de resultados mais reprodutíveis

16 Material Tubos de Ensaio; Pipetas graduadas; Macrocontrolador de Pipetas; Espectrofotómetro; Cuvetes; Albumina a 0,4%; Água desionizada; Amostra; Reagente (biureto).

17 Procedimentos Procedimentos dos grupos I e III 1. Fazer uma curva padrão segundo o esquema: TUBOS ALBUMINA 0,4% H 2 O REAGENTE DO (540 nm) 1 0 ml 2,00 ml 2 ml 2 0,25 ml 1,75 ml 2 ml 3 0,45 ml 1,55 ml 2 ml 4 0,65 ml 1,35 ml 2 ml 5 0,85 ml 1,15 ml 2 ml 2. Ler a DO a 540 nm. O tubo 1 deve ser ajustado a zero de absorvância, passando a funcionar como branco, para que a curva padrão passe na origem do gráfico.

18 Procedimentos Procedimentos dos grupos II e IV 1. Preparar as amostras fazendo uma diluição do soro sanguíneo de 20 vezes com o soro fisiológico. As amostras devem ser preparadas em duplicado e determinada a média, conforme o seguinte esquema. DO (540 nm) 0,5 ml AMOSTRA 1,5 ml H 2 O 2 ml de reagente 0,5 ml AMOSTRA 1,5 ml H 2 O 2 ml de reagente MÉDIA Esperar 10 minutos. 2. Ler a DO a 540 nm. 3. Fazer os cálculos para a determinação da quantidade de proteína no soro sanguíneo (mg/ml; g/l), tendo em conta o factor de diluição (20x).

19 Resultados

20 Resultados do grupo I Exemplificação do cálculo da massa de Albumina 0,4% TUBO 2 0,4g 100ml x 0,25ml x = 1 mg TUBO Albumina (mg) DO (540 nm) , ,8 0, ,6 0, ,4 0,148 DO (540 nm) 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0, Massa de Albumina (mg) Tabela 1 Valores de absorvância obtidos para 540 nm, e a quantidade de albumina, em mg, presente no respectivo um. Gráfico 1 - Relação entre massa de albumina na amostra, em miligramas, e absorvância para 540 nm.

21 Resultados do grupo III TUBO Albumina (mg) DO (540 nm) , ,8 0, ,6 0, ,4 0,237 DO (540 nm) 0,16 0,26 0,24 0,14 0,22 0,12 0,2 0,18 0,16 0,14 0,08 0,12 0,06 0,1 0,08 0,04 0,06 0,02 0,04 0, Massa de Albumina (mg) Tabela 2 Valores de absorvância obtidos para 540 nm, e a quantidade de albumina, em mg, presente no respectivo um. Gráfico 2 - Relação entre massa de albumina na amostra, em miligramas, e absorvância para 540 nm.

22 Resultados e Cálculos do grupo II Tubo 1 0,272 Tubo 2 0,279 Absorvância=0,276 Nota: Devido aos erros do gráfico do Grupo I, o Grupo II guiou-se pelo gráfico do Grupo III. Média da DO para os dois tubos: 0,276 3,96 mg de albumina Se 3,96 mg proteína Logo 7,91 mg proteína 0,5 ml de amostra 1 ml de amostra Concentração no soro, tendo em conta o factor de diluição (20 x), é de 7,91 x 20 = 158 mg/ml

23 Resultados e Cálculos do grupo IV Tubo 1 0,234 Tubo 2 0,226 Absorvância=0,230 Média da DO para os dois tubos: 0,230 3,25 mg de albumina Se 3,25 mg proteína Logo 6,50 mg proteína 0,5 ml de amostra 1 ml de amostra Concentração no soro, tendo em conta o factor de diluição (20 x), é de 6,50 x 20 = 130 mg/ml

24 Discussão Verificamos que quanto maior é o volume de albumina, mais azul fica a solução após a adição de reagente biureto; e que quanto maior a concentração de albumina, maior é a absorvância (D.O.). A partir da média das absorvâncias das duas amostras (D.O. = 0,23), encontrámos o valor da quantidade da proteína albumina no soro sanguíneo (através do gráfico da curva-padrão) e, tendo em conta o factor de diluição de 20x, multiplicámos por 20. O valor obtido de 130 mg/ml é bastante acima dos valores normais [N g/l], o que pode indicar que estamos perante um indivíduo com hiperproteinémia ou que ocorreram erros experimentais significativos.

25 Discussão Apesar de o gráfico obtido se aproximar de uma recta, não o é. Este facto contraria a Lei de Lambert-Beer, o que pode ser explicado pelo facto de existirem erros experimentais: erros de medições, erros de calibração, erros associados aos aparelhos, entre outros. O espectrofotómetro apenas teve em conta o valor da absorvância da proteína albumina, havendo outras proteínas no soro cuja absorvância é desprezada.

26 Conclusão Através da leitura da densidade óptica de uma amostra de sangue por espectrofotometria, é possível determinar a quantidade de proteína existente no sangue e a sua concentração, ou proteinémia. A determinação da proteinémia é importante no diagnóstico de variadas patologias (tais como síndromes infecciosos, perdas renais, processos neoplásicos, processos de absorção deficiente, entre outros) já que as proteínas plasmáticas desempenham variadas funções no organismo e as alterações da sua concentração podem ter causas patológicas.

27 Bibliografia BERG, Jeremy M.; TYMOCZKO, John L.; STRYER, Lubert; Biochemistry; Freeman, 6th Edition, Protocolos experimentais de Bioquímica I.