Disciplina de BIOQUÍMICA do Ciclo Básico de MEDICINA Universidade dos Açores 1º Ano ENSINO PRÁTICO 4ª AULA PRÁTICA
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- Rayssa Azambuja Sousa
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1 Disciplina de BIOQUÍMICA do Ciclo Básico de MEDICINA Universidade dos Açores 1º Ano ENSINO PRÁTICO 4ª AULA PRÁTICA CONCEITO DE SOLUÇÕES TAMPÃO, ph E pk 1. Conceito de soluções tampão (ph e pk) 2. Principais tampões fisiológicos 3. Efeito tampão e sua eficiência
2 Importância da concentração de H + nos sistemas biológicos O ião de hidrogénio (H + ) é, de entre todos os iões inorgânicos, talvez aquele que exerce maior influência na célula, por unidade de concentração. Muitas das moléculas das estruturas celulares e dos vários sistemas de enzimas, ionizam-se e existem em equilíbrio com os protões livres da célula. Se representarmos os grupos ionizados destas estruturas e enzimas por R -, poderemos representar o equilíbrio com H + pela seguinte equação: RH R - + H + (1) em que K A representa a constante de dissociação do ácido. K A A concentração de H + determina, portanto, as concentrações de R - e RH, que representam, respectivamente, as moléculas dissociadas e em combinação com H +. Deve notar-se que a associação de H + com R - para formar RH determina também a concentração de H + livre e que, quanto maior for a afinidade de R - por H +, menor será a concentração de H + livre. Muitas reacções que ocorrem na célula dependem da carga eléctrica das moléculas dos sistemas envolvidos. Por exemplo, a actividade das enzimas, a permeabilidade da membrana plasmática, o transporte activo de substâncias concentradas selectivamente na célula, são dependentes da concentração de H +, provavelmente porque este ião determina a carga eléctrica das moléculas e estruturas celulares. Geralmente, existe uma concentração óptima de H + para cada mecanismo celular. Concentrações inferiores ou superiores a essa concentração são, em geral, inibidoras, como se indica no caso específico das actividades enzimáticas (Fig. 1). Actividade enzimática ph óptimo 1
3 (% do máximo) ph Fig. 1. Relação entre o ph do meio e a actividade enzimática O ph óptimo da enzima representada na figura é de aproximadamente 7,0. Apesar do ph óptimo de actuação de uma variedade de enzimas ser de aproximadamente 7, existem excepções significativas; por exemplo, a enzima pepsina, uma protease do estômago, tem um ph óptimo de 1,5. O ph do estômago é bastante ácido (ph = 1), podendo a enzima funcionar neste meio. Um aumento do ph (redução de [H + ]) aumenta a dissociação das substâncias, nomeadamente das proteínas, e aquelas com um pk relativamente baixo, dissociam-se primeiro. Normalmente, ao ph das células (± 6,5-7,0), as proteínas possuem uma carga predominantemente negativa e podem, portanto, absorver iões H + produzidos pelo metabolismo da célula. Esta reacção entre as proteínas ou outras substâncias capazes de absorverem H + (por ex., HPO 4 2- e HCO 3 - ) é rápida e é, portanto, responsável por evitar flutuações na concentração de H + na célula durante a sua actividade. Porém, torna-se, eventualmente, necessário dispor de iões H +, temporariamente absorvidos pelas várias substâncias que entram em combinação com este ião. Ácidos e Bases Um ácido, segundo a definição de Bronsted, é uma substância dadora de H +, enquanto que uma base absorve H +. Na descrição que se segue, faremos referência somente aos ácidos, especialmente ácidos fracos, que se dissociam parcialmente e existem em equilíbrio, em solução com o H + e A - produzidos pela dissociação: K A HA H + + A - (2) 2
4 onde HA representa o ácido, A - a quantidade do ácido que se dissociou e K D representa a constante de dissociação, a qual se pode expressar pela equação (3): [ H + ] [A - ] K a = (3) [HA] ácidos. Em relação às bases, as considerações são idênticas às que foram descritas para os Os ácidos fortes, tais como o HCl, dissociam-se completamente e, portanto, em água, a concentração de H + ou Cl - é igual à concentração original do ácido. Assim, 0,1 M de HCl produz 0,1 M de H + e 0,1 M de Cl -. No caso dos ácidos fracos, tais como o ácido acético, a concentração de H + produzida pelo ácido em solução aquosa é inferior à concentração original do ácido, porque só parte do H + do ácido se dissocia. A concentração de H + dissociado pode calcular-se pela equação (3), que pode ser representada como se segue: [HA] [H + ] = K a (4) [A - ] ou [HA] - log [H + ] = - log K D - log (5) [A - ] A [H + ] é geralmente indicada pelo valor do ph que é definido como o negativo do logaritmo da concentração de [H + ]. Portanto: [HA] ph = - log K A - log (6) [A - ] 3
5 Verifica-se na equação (6) que, quando as concentrações de HA e A - são iguais, o ph é igual a - log K D. O valor de - log K a é uma constante característica de cada ácido e é definida como o ph a que as concentrações de HA e A - são iguais. Esta constante (-log K a ) representa-se pelo símbolo pka. Portanto: [A - ] ph = pk a + log (7) [HA] Esta equação é a equação de Henderson-Hasselbalch, a qual é muito útil para calcular o ph de soluções de ácidos fracos. Dissociação da água A água actua como um ácido e como uma base, uma vez que produz H + e OH - : K e H 2 O H + + OH - (8) onde Ke é a constante do equilíbrio da reacção. A concentração de H + concentração de OH -. O valor de Ke é: produzido pela água é relativamente baixa e é igual à [H + ] [OH - ] K e = (9) [H 2 O] Como a concentração da água [H 2 O] é relativamente alta e constante (é igual ao número de gramas de H 2 O num litro, dividido pelo peso molecular da água, ou seja 1000/ 18 = 55,55 M), o produto Ke [H 2 O] pode expressar-se pela constante Kw (produto iónico da água). Portanto: 4
6 Kw = [H + ] [OH] = (10) Se expressarmos esta equação em termos dos logaritmos dos valores representados: pkw = ph + poh = 14 (11) onde poh tem o valor do - log [OH] por analogia com o valor de ph definido acima. Uma vez que consideraremos somente ácidos e bases fracos em água, o produto das concentrações de [H + ] e [OH - ] será igual a (ou a soma ph + poh = 14). Portanto, se a concentração de H + dum ácido fraco em água for de 10-5 M, a concentração de OH - nessa mesma solução será de 10-9 M. Esta relação é válida para valores de ph entre 0 e 14. Apesar da concentração de H + poder ser expressa em termos de normalidade (N) ou molaridade (M), é um pouco inconveniente, uma vez que se tem de recorrer ou a potências (ex.: 10-6 M) ou a decimais (ex.: 0, M). Assim, para evitar esta dificuldade Sorensen escolheu arbitrariamente expressar a concentração de H + como o negativo do seu logaritmo e designou esta função de ph: ph = - log 10 [H + ] (12) Na tabela I indica-se a relação entre concentração de H +, de OH - e o ph. 5
7 TABELA I. Relação entre concentração de H + expressa em normalidade e o ph [H + ] [ OH - ] log [H + ] - log [H + ] = ph 1N 10 0 N N ,1 N 10-1 N N ,001 N 10-3 N N , N 10-5 N 10-9 N , N 10-7 N 10-7 N , N 10-9 N 10-5 N , N N 10-3 N , N N 10-0 N Tampões Um tampão é, geralmente, uma mistura dum ácido fraco e do seu sal, capaz de absorver ou libertar H +, de modo a evitar alterações na concentração deste ião. Um termo mais descritivo para este sistema seria amortecedor, pois o seu efeito é manter um meio constante, no que diz respeito à concentração de H +, em face de produção ou gasto deste ião por qualquer reacção a nível celular. Eficiência do Tampão A eficiência dum sistema tampão, refere-se à eficácia do sistema para manter a concentração de H +, constante. Quantos moles de H + (ou OH - ) podem ser adicionados a um meio contendo um sistema tampão para alterar significativamente a concentração de H +? Claro que o número de moles necessário é tanto maior quanto mais eficiente for o sistema tampão. Pela equação de Henderson-Hasselbalch, pode verificar-se que a alteração do valor de ph (e portanto da concentração de H + ) depende da razão [A - ]/ [HA], isto é, depende das concentrações do ácido, [HA], e do sal do ácido, [A-]. Uma análise cuidadosa da equação revela também que o sistema tampão (isto é, mistura do ácido e do seu sal) é mais eficiente na manutenção do ph constante, quando [HA] = [A - ] e, portanto, quando ph = pka. Na 6
8 prática, utiliza-se um tampão para manter o ph constante. Este é mais eficiente na gama de valores de ph situados entre uma unidade inferior e uma unidade superior ao valor do pka do ácido fraco (ou base fraca) que serve de tampão. Fora desta gama, a eficiência do tampão é muito reduzida, como se pode verificar na fig. 2, que representa a titulação do ácido acético e do amónio com NaOH. CH 3 COOH CH 3 COO - + H + Fig. 2. Curva de titulação de um ácido fraco, o ácido acético, com um pka = 4,7 Analisando a curva de titulação do ácido acético representada na figura 2 pode verificar-se no início da curva que, a adição de 0,1 do equivalente de NaOH, causa uma alteração no ph de aproximadamente uma unidade. Porém, para valores de ph entre 3,76 e 5,75 (ou seja, uma unidade de ph inferior e uma unidade de ph superior ao pka do ácido) a adição de mais NaOH, aumenta mais lentamente o ph. Fora destes valores de ph, uma 7
9 pequena adição de NaOH causa um aumento relativamente grande no valor do ph. O ácido acético pode, portanto, ser usado como tampão na gama de ph entre 3,76 e 5,76. Para se tamponizar uma solução noutra gama de ph, é necessário usar-se um ácido fraco (ou base fraca) cujo valor do pka corresponda ao ph desejado. Para se preparar o tampão, titula-se o ácido até se obter o ph desejado. Os tampões mais comuns, porque são eficientes a ph fisiológico, são os de fosfato (preparados de ácido fosfórico ou de sais de fosfato), histidina e imidazol. Todas estas substâncias possuem pka entre 6 e 8. Para o caso do ácido fosfórico, com três equivalentes de H + por mole (H 3 PO 4 ), existem três valores de pka. Este ácido pode portanto, servir de tampão em três regiões de ph, correspondentes aos valores de pka do ácido (pka 1 = 2,1; pka 2 = 7,2; pka 3 = 12,3). Fig. 3. Curva de titulação do ácido fosfórico. No caso dos aminoácidos, os grupos carboxílicos dissociam-se a um ph mais baixo do que o ph a que se dissociam os grupos amínicos (Tabela II): 8
10 Tabela II. Os grupos químicos dos aminoácidos e os seus valores de pka. Grupo das proteínas Reacção de dissociação pk Carboxílico COOH COO - + H + 3-4,7 + Imidazol HC NH HC N + H + 6,1 HC CH HC CH N H N H Amínico NH 3 + NH 2 + H + 6,5-10,5 Um aminoácido como a glicina tem dois grupos ionizáveis, logo aprsentará as seguintes formas de ionização, com duas regiões com poder tampão: PK 1 = 2,3 pk 2 = 9,6 H 2 C - COOH H 2 C - COO - + H + H 2 C - COO - + H + NH + 3 NH + 3 NH 2 No caso de aminoácidos com mais de um grupo carboxílico, a curva que representa a titulação do aminoácido com uma base, apresenta uma região tampão para cada grupo carboxílico, além da região tampão correspondente ao grupo amínico. Como exemplo, apresenta-se a dissociação do ácido aspártico: 9
11 COOH COO - COO - COO - pk 1 = 2,1 pk 2 = 3,9 pk 3 = 9,8 HC - NH + 3 HC - NH H + HC - NH H + HC - NH 2 +H + CH 2 -COOH CH 2 -COOH - CH 2 -COO - CH 2 -COO - Carga eléctrica (+1) (0) (-1) (-2) As proteínas possuem vários aminoácidos e, portanto, grupos carboxílicos e amínicos, que se ionizam a diferentes valores de ph. Isto explica o facto de as proteínas serem bons tampões contribuindo para a manutenção do ph nas células. Regulação do ph nos sistemas biológicos No organismo humano existem diversos tipos de regulação do ph (Tabela III). Tabela III. Regulação da concentração de ph nos sistemas biológicos. Tipo de regulação Função Tempo necessário 1. Tampões químicos Combinam-se com o H + milisegundos (Proteínas, HCO 3 -, HPO 4 2- ) (Pr (proteína) + H + PrH) 2. Respiração Eliminação de CO 2 nos pulmões minutos (H + + HCO 3- H 2 CO 3 CO 2 + H 2 O) 3. Regulação renal Secreção de H + horas Reabsorção de HCO e HPO 4 Para além dos tampões químicos, a respiração e a regulação renal têm um papel de relevo os sistemas respiratório e renal. 10
Homeostase do ph. Ácidos e Bases. HA H + + A - HCl H + + Cl - H 2 CO 3 H + + HCO H + + NH 3. Escala de ph
Frederico Gueiros Filho Formação: Bacharelado em Biologia - UERJ Mestrado em Genética - UFRJ Doutorado - Harvard Medical School - EUA Pós-doutorado - Harvard, Depto. MCB - EUA Interesse de pesquisa: Mecanismo
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