PADRONIZAÇÃO DO PROCEDIMENTO DE LISE CELULAR PARA A OBTENÇÃO DE PROTEÍNAS POTENCIALMENTE UTILIZADAS COMO AGENTE ANTIVIRAL

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1 PADRONIZAÇÃO DO PROCEDIMENTO DE LISE CELULAR PARA A OBTENÇÃO DE PROTEÍNAS POTENCIALMENTE UTILIZADAS COMO AGENTE ANTIVIRAL Augusto H. Nozella, 2 Kamilla Alves Carvalho, 3 Érika Ohta Watanabe e 3 Fabiana Regina X. Batista Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFU), discente do curso de Engenharia Química 2 Discente do curso de pós-graduação da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG,2,3 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 22, Bloco K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP frxbatista@feq.ufu.br RESUMO - O conhecimento multidisciplinar tem viabilizado avanços significativos na produção de biofármacos através do uso de células animais. Este estudo propõe à padronização da metodologia de lise celular de culturas de E. coli que foram modificadas geneticamente para a síntese de proteína heteróloga utilizada como potencial agente antiviral. Tal proteína, uma vez extraída das bactérias, quantificada através do método de Lowry e precipitada por meio do uso de sais voláteis serão potencialmente administradas em culturas de células animais (Vero) infectadas com o vírus do sarampo. Para tal, a suspensão bacteriana foi ressuspensa em tampão fosfato de ph 7 e lisada mecanicamente através do uso de ultrassom. Em geral, o rompimento celular por ultrassom é utilizado em escala de laboratório e ocorre quando ondas sonoras são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação. Essas vibrações formam bolhas muito pequenas que entram em colapso e geram ondas de choque que circulam no meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, com conseqüente rompimento celular. Diferentes intervalos de tempo foram empregados (0, 30 e 20min) e os resultados mostraram que um período de 30min é suficiente para que a lise celular ocorra com sucesso. Palavras-Chave: proteínas, agente antiviral, lise celular. INTRODUÇÃO No mundo inteiro, o sarampo atinge milhões de pessoas anualmente e segundo a Organização Mundial de Saúde mata cerca de (ONU, 203). Até 200, julgava-se que o sarampo havia sido erradicado no Brasil. Contudo, recentemente, a mídia impressa relatou casos da doença na região nordeste do país, além de casos importados de outros países nos quais a doença está ocorrendo (ONU, 204). O sarampo é uma doença infecciosa aguda, de natureza viral, grave, transmissível e extremamente contagiosa causada pelo vírus pertencente ao gênero Morbillivirus, família Paramyxoviridae. Assim, a determinação de agentes capazes de inibir a replicação deste vírus torna-se necessária. Para tal, destaca-se o uso de células animais. Estas células atuam como substratos para a replicação viral e testes in vitro com diferentes agentes podem ser efetuados para verificar suas respectivas ações. Após a infecção as substâncias de interesse com potencial ação antiviral são administradas nas culturas em concentrações diferentes analisandose o efeito desta variação na replicação viral. A utilização de proteínas heterólogas na produção destes agentes vem crescendo nos últimos anos. Destacam-se neste contexto os avanços na tecnologia do DNA recombinante como uma via para a codificação de genes produtores de proteínas humanas obtidas em hospedeiros diversos, como bactérias e outros micro-organismos. Em 2006 segundo Souza (2006), este mercado movimentou cerca de 50 a 60 bilhões de dólares. Bactérias gram-negativas (como a Escherichia coli) utilizadas neste trabalho apresentam grandes vantagens na expressão de proteínas heterólogas, como baixos custos de produção, rapidez na biossíntese, alta capacidade de replicação. Entretanto, após a síntese destas proteínas faz-se necessário um procedimento de quantificação. Para tanto métodos espectrofotométricos vêm sendo amplamente empregados. Entre os comumente usados

2 destacam-se: o método do biureto, de Lowry (95) e Bradford (976). O método de Lowry (95) quando comparado com outros métodos se mostra mais sensível, com maior exatidão e menor susceptibilidade a ação de interferentes (Zaia et al, 998). Assim, este estudo propõe à padronização da metodologia de lise celular de culturas de E. coli que foram modificadas geneticamente para a síntese de proteína heteróloga utilizada como potencial agente antiviral. Tal proteína, uma vez extraída das bactérias por intermédio da lise celular, foi quantificada através dos métodos de Bradford (976) e Lowry (95) e será precipitada (Watanabe, 2004) por meio do uso de sais voláteis, sendo posteriormente administrada em culturas de células Vero infectadas com o vírus do sarampo. MATERIAIS E MÉTODOS Sistema de expressão de proteínas heterólogas As culturas de E. coli modificadas para a expressão da proteína de interesse com ação antiviral usadas neste trabalho foram gentilmente cedidas pelo pesquisador Dr. Ronaldo Zucatelli Mendonça, líder do Laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan/SP, e conservadas em freezer à -20 C. Para a execução das análises, amostras da suspensão celular foram descongeladas e ressuspensas em 20 ml de tampão fosfato de ph 7. Lise celular A suspensão celular foi submetida à lise por meio de ultrassom (Ultrassonic Processor/GE505). A configuração utilizada neste trabalho foi de 2s de ação ultrassônica para s de repouso, sendo a amplitude de onda 40%. Alíquotas de 00 µl foram retiradas em tempos variados de lise: 5 min, 0min, 50min, 90 min, 20mim e centrifugadas durante 0min a rpm. A variação de tempos descrita foi utilizada para o método de quantificação proteica de Bradford (976). Para a quantificação de proteínas através do método de Lowry (95) alíquotas de ml foram retiradas em três tempos diferentes de lise: 0 min, 30 min, 20 min e centrifugadas durante 0 min a 8000 rpm. Em ambos os procedimentos de quantificação o sobrenadante rico em proteínas foi coletado enquanto o pellet contendo debris (resíduos de células) foi descartado. Quantificação de proteínas totais As amostras protéicas foram submetidas inicialmente ao método de Bradford (976) seguindo as etapas abaixo para preparação do reagente principal: Dissolveu-se 0,g de Coomassie Brilliant Blue G-250 em 50 ml de etanol 95% (47,73 ml de etanol 99,5% + 2,26 ml de água). Adicionou-se a solução inicial 00 ml de ácido fosfórico 85% sob agitação. Agitou-se a solução por mais 2 horas e o volume L de água ultrapura foi completado. A agitação ocorreu por aproximadamente 5 horas. O reagente foi filtrado em frasco coberto com papel alumínio, permanecendo em repouso por 24 horas antes de ser utilizado. Após tal procedimento, 000 µl do reagente de Bradford foram adicionados a 20 µl de amostra protéica. Só então a solução foi agitada durante 5 s e após um período de tempo de 0 minutos, leituras de absorbância no espectrofotômetro (Thermo Spectronic/Genesys 0uv), para um comprimento de onda de 595 nm, foram realizadas Salienta-se que o mesmo sobrenadante também foi submetido a outro método espectrofotométrico, em nível de comparação, o método de Lowry (95), para a quantificação de proteínas. O procedimento foi realizado a partir do uso das soluções abaixo discriminadas. Reativo A: 2g de Na 2 CO 3 seco e 0,02g de tartarato duplo de sódio e potássio foram dissolvidos 00mL de NaOH (0,M). Reativo B: 0,5g de CuSO 4 e 2 gotas de H 2 SO 4 concentrado foram adicionados em 00mL de água destilada. Solução AB: 50mL do reativo A e ml do reativo B foram conjugados, havendo a necessidade do preparo imediatamente antes da dosagem. Reativo Folin (N). Amostras de,0 ml do sobrenadante contendo as proteínas e 3mL da solução AB foram adicionadas em um frasco protegido da luz e um período de 0 minutos foi despendido para que a reação fosse observada. Após isso 0,3mL do reativo de Folin (N) foi adicionado e 30 minutos se passaram ao abrigo da luz. Ao final realizou-se a medida da absorbância a 760 nm. É importante ressaltar que para que a concentração protéica de uma amostra desconhecida fosse determinada curvas de

3 calibração foram previamente construídas. Para tal, análises de absorbância de uma solução padrão de albumina bovina (BSA) com concentrações variando no intervalo compreendido entre: 0mg/L e 00mg/L; 00mg/L e 000mg/L foram realizadas para o método de Lowry (95). Para o método de Bradford (976) o intervalo de variação das concentrações foi compreendido entre: 00 mg/l e 000mg/L. RESULTADOS E DISCUSSÃO impedem a reação com o corante, ou reagem com o corante, causando superestimação da concentração de proteína e o grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedência. Em vista disso, o método de Lowry (95) foi também utilizado na determinação da proteína total. As Figuras 2 e 3 apresentam as curvas de calibração para as condições de macro e micro ensaios, respectivamente. Inicialmente o método de Bradford (976) para a determinação protéica foi empregado. Na primeira etapa utilizou-se uma curva de calibração definida como macro ensaio (Figura ). Figura 2 Curva de calibração de macro ensaio método de Lowry (95) Figura - Curva de calibração macro ensaio método de Bradford (976) Contudo, os resultados mostraram não haver diferença entre os valores de absorbância obtidos para os diferentes tempos empregados no procedimento de lise celular (Tabela ). Tal fato pode ser atribuído a ação de interferentes. Tabela Absorbância e concentração proteica obtida para diferentes tempos de lise celular (Bradford, 976) Amostra Tempo de lise (min) ABS (595nm) Proteínas (mg/ml) A 5 0,786±0,0459 0,782±0,0554 B 0 0,767±0,0035 0,758±0,0042 C 50 0,74±0,0254 0,695±0,0307 D 90 0,82±0,0063 0,83±0,0076 E 20 0,826±0,0509 0,830±0,064 Zaia et al. (998) destacaram que alguns aspectos podem interferir na quantificação proteica por Bradford (976). São eles: a variação da absortividade específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade ou baixa massa molecular da proteína; presença de interferentes que reagem com a proteína e Figura 3-Curva de calibração micro ensaio método de Lowry (95) A curva acima representada pela Figura 2 (R 2 = 0,955) forneceu a Equação, que relaciona a concentração proteica à absorbância. Conc. BSA=69,3*ABS- 79,89 Eq. Neste caso o procedimento de Lowry se mostrou satisfatório, uma vez que se obteve uma curva de calibração que contemplou os valores de absorbância obtidos para os variados tempos de lise empregados.

4 A Tabela 2 demonstra os dados de absorbância obtidos para os tempos de lise de 0, 30 e 20min. Tabela 2 Absorbância e concentração proteica obtida para diferentes tempos de lise celular (Lowry, 95) Amostra Tempo de lise (min) ABS (760nm) Proteínas (mg/ml) F 0 min 0,385±0, ,54±6,03 G 30 mim 0,663±0, ,706±58,0 H 20 mim 0,723±0, ,864±52,67 A partir dos dados de absorbância foi possível quantificar o teor de proteínas totais obtido mediante a variação do tempo de lise celular. É perceptível um aumento significativo da concentração proteica da amostra F para a amostra G. Entretanto a diferença não é tão acentuada quando se analisa a variação da concentração de proteínas presentes na amostra G e na amostra H. Possivelmente a maior parte das células já havia se rompido após 30 minutos de lise, de modo que o acréscimo no tempo de lise não acarretou em aumento de concentração proteica no sobrenadante como é possível verificar na Figura 4. Figura 4- Variação da concentração proteica em função do tempo de lise celular (Lowry, 95). Assim, sugere-se que um tempo de lise de 30 minutos seria suficiente para promover a extração plena das proteínas contidas no interior celular e com isso outras etapas de recuperação e purificação poderiam ser utilizadas. CONCLUSÕES As análises realizadas permitiram a padronização do procedimento de lise celular e mostraram que 30 minutos em ultrassom foram suficientes para promover o completo rompimento celular. Por fim, observou-se que para a condição avaliada o método Lowry (95) mostrou-se mais vantajoso na determinação protéica quando comparado ao método de Bradford (976). AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Universidade Federal de Uberlândia e a Faculdade de Engenharia Química pela oportunidade em realizar este trabalho. Agradecem também ao apoio financeiro da FAPEMIG, do CNPq e da CAPES, além da assessoria científica da aluna de pós-graduação Janaína Fisher na execução das etapas experimentais. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRADFORD, M. M. A Rapid and Sensitive Method for a Quantitation of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein Dye Binding. Analytical Biochemistry, 72 (976) LOWRY, O. H. Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Journal of Biological ONU BR - Nações Unidas no Brasil. OMS: Mortes por sarampo caem 7%, mas surtos em algumas regiões comprometem progresso Disponível em: < Acesso em: 0 de fevereiro de 204. ONU BR - Nações Unidas no Brasil. Agências da ONU apontam queda global de 78% nas mortes por sarampo Disponível em:< Acesso em: 7 de fevereiro de 204. SOUZA, T, M, M. Produção de proteínas de interesse terapêutico em células de mamíferos em cultura. Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular da Universidade de Brasília. Brasília, WATANABE, E. O. Estudo da precipitação de tripsina com o uso de sais voláteis. Dissertação de Mestrado. Faculdade de

5 Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas. Campinas, 2004 ZAIA, A. M., ZAIA, B. V., LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, 2 (998)