Casa Rosada Buenos Aires, AR abril de 2008 W.J.Melo

Transcrição

1 Casa Rosada Buenos Aires, AR abril de 2008

2 RODOVA MAR DEL PLATA - BUENOS ARES

3 DETERMNAÇÃO QUANTTATVA DE PROTEÍNAS

4 Proteínas AVALAÇÃO QUANTTATVA!Há vários métodos para determinação quantitativa de proteínas em amostras de tecido animal, vegetal, de microrganismos, alimentos, etc.!a seleção de um ou outro método depende da sensibilidade desejada e do tipo de equipamento disponível.!métodos: titulométricos, colorimétricos, turbidimétricos, espectrofotométricos,

5 Proteínas MÉTODOS DE AVALAÇÃO DE PROTEÍNAS!Métodos titulométricos #Determinação do N-total #Proteína= 6,25 x N-total!Métodos colorimétrocs #Macrobiureto, microbiureto, Lowry, Hartree!Métodos turbidimétricos #Precipitação da proteína com TCA!Métodos espectrofotométricos #Leitura da absrobância no UV (E280, E260)

6 Proteínas REAÇÃO COM BURETO!Biureto #Constituição CuSO 4.5H 2 O - o Cu é o elemento ativo do reagente. tartarato duplo de sódio e potássio - complexar o Cu para evitar formação de óxido cúprico (precipitado preto) sob aquecimento. hidróxido de sódio - alcalinizar o meio iodeto de potássio - evitar auto-oxidação do Cu #Reação

7 REAÇÃO DO BURETO O=C R-C-H O=C NH NH R 1 -C-H proteína O=C R-C-H O=C R 1 -C-H + Cu + NH NH Cu HN HN C=O H-C-R C=O H-C-R 1 complexo de cor violeta HN HN C=O H-C-R C=O H-C-R 1 proteína

8 Proteínas MÉTODO MACROBURETO!Método espectrofotométrico!baseia-se na reação da proteína com o reagente macrobiureto #As proteínas reagem com o biureto, formando um complexo de cor violeta!componentes do macrobiureto #sulfato de cobre pentaidratado, tartarato duplo de sódio e potássio, hidróxido de sódio, iodeto de potássio!sensibilidade #O método macrobiureto consegue determinar proteínas em concentrações de 30 a 250 mg L -1

9 Proteínas MÉTODO DO MACROBURETO O=C R-C-H O=C NH NH Cu HN HN C=O H-C-R C=O R 1 -C-H H-C-R 1 complexo de cor violeta

10 Proteínas MÉTODO MACROBURETO ETAPAS CURVA DE CALBRAÇÃO EXTRAÇÃO CÁLCULOS APLCAÇÃO

11 Proteínas MÉTODO DO MACROBURETO!Curva de calibração #Tem o objetivo de relacionar a concentração de uma solução protéica padrão (soroalbumina bovina) com a absorbância. #A vários tubos de ensaio, colocam-se concentrações diferentes de uma proteína padrão, aplica-se a reação de cor e lê-se a absorbância do complexo colorido. #A relação absorbância/concentração é uma reta dentro de certos limites concentração.

12 Proteínas MÉTODO DO MACROBURETO!Curva de calibração #A 7 tubos de ensdaio, adicionar, respectivamente, 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 e 1,4 ml da solução padrão de proteína (albumina bovina 1%) #Completar o volume a 4 ml com água destilada #Adicionar a cada tubo 4 ml da solução de macrobiureto #Aguardar 15 minutos e ler a absorbância a 540 nm

13 Proteínas MÉTODO DO MACROBURETO -EXTRAÇÃO!Aplicação a uma amostra de folha #Pesar 1,0 g de tecido fresco de folha e colocar em almofariz. #Adicionar 7 ml de água destilada, um pouco de areia lavada e extrair a proteína solúvel em água. #Transferir para tubo de centrífuga e centrifugar (15 minutos a rpm). #Transferir o sobrenadante para balão volumétrico de 10 ml e completar o volume com água destilada.

14 MACROBURETO - EXTRAÇÃO Proteínas!Pipetar 4 ml do extrato para tubo de centrífuga e adicionar 1 ml de solução de TCA 50%.!Agitar e centrifugar (10 minutos a rpm).!suspender o precipitado em 5 ml de acetona gelada (5 o C).!Centrifugar e ressuspender em 5 ml de acetona gelada. Repetir a operação até que o sobrenadante se apresente sem coloração.!suspender o precipitado em 2 ml de solução de NaOH 0,1 mol L -1.!A solução obtida é o extrato de proteína.

15 Proteínas MACROBURETO APLCAÇÃO AO EXTRATO OBTDO!O extrato de proteína obtido deve ser submetido à mesma seqüência usada para a obtenção da curva de calibração. #Pipetar um volume menor que 4 ml do extrato de proteína para tubo de ensaio (no caso, 0,6 ml). #Adicionar volume de água para completar o volume de extrato usado a 4 ml (no caso, 3,.4 ml). #Adicionar 4 ml do reativo do macrobiureto, agitar bem e aguardar 15 minutos. #Ler a absorbância do complexo colorido em com-primento de onda de 540 nm.

16 Proteína MÉTODO MACROBURETO CÁLCULOS!Curva de calibração #1. Método da relação Absorbância/Conentração #2. Método da Regressão Linear!Concentração de proteína na amostra de folha

17 MÉTODO DA RELAÇÃO CONCENTRAÇÃO/ABSORBÂNCA

18 A RELAÇÃO CONCENTRAÇÃO/ABSORBÂNCA É CONSTANTE tg = absorbância concentração concentração

19 MACROBURETO - RESULTADOS Tubo Padrão Água Abs Abs-Br Conc. Conc./Abs-Br ml ml g L ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,4 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,4 0,155 0,184 0,252 0,301 0,347 0,398 0,420 0,000 0,029 0,097 0,146 0,192 0,243 0,265 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3, ,24 10,31 10,27 10,42 10,29 13,21 Média 11,96

20 MÉTODO DA REGRESSÃO LNEAR

21 MACROBURETO CURVA DE CALBRAÇÃO 0,3 0,2 - - y= 0,0829x + 0,0086 r 2 = 0,095 0,1 - x= 12,0627y - 0,1037 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Proteína (g L -1 )

22 MACROBURETO - CÁLCULOS PROTEÍNA NO EXTRATO PROTÉCO Proteínas!Absorbâncias #Amostra: 0,420 #Branco: 0,155!Método da relação Conc/Abs #proteína (mg ml -1 )= 11,95 x (Aa - Ab) #proteína (mg ml -1 )= 11,95 x (0,420-0,155) #proteína (mg ml -1 )= 3,17!Método da regressão linear #proteína (mg ml -1 )= 12,06 x (Ab - Ab) -0,10!Proteína (mg ml -1 )= 12,06 x (0,420-0,155) -0,10 #proteína (mg ml -1 )= 3,10

23 Proteínas MACROBURETO - PROTEÍNA NA AMOSTRA!Diluições do extrato #1. 1,0 g de folha 10 ml #2. 0,6 ml extrato 4 ml #Fd= 10/1 x 4/0,6= 66,67!Concentrações do extrato #1. 4 ml 2 ml #Fc= 4/2= 2!Proteína na amostra de folha #proteína (mg kg -1 )= Conc extrato x Fd/Fc #proteína (mg kg -1 )= 3,17 x 66,67/2 #proteína (mg kg -1 )= 105,67