EFEITO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL NA SOLUBILIDADE DE QUIMOTRIPSINA EM SOLUÇÃO DE SAIS

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1 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO INICIAL NA SOLUBILIDADE DE QUIMOTRIPSINA EM SOLUÇÃO DE SAIS 1 Carolina M. Marinho e 2 Érika O. Watanabe 1 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFU, discente do curso de Engenharia Química 2 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 1,2 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP erika@feq.ufu.br RESUMO - A precipitação de proteínas em solução aquosa com subsequente tratamento do precipitado constitui uma das mais importantes operações unitárias para as indústrias de recuperação e purificação de proteínas. Essa etapa é bastante utilizada pela alta capacidade de concentrar a molécula de interesse e pelo seu baixo custo, por isso presente em mais da metade dos processos de purificação. O objetivo deste trabalho foi o estudo do efeito da concentração inicial de proteína e tipo de sal na solubilidade da quimotripsina em solução dos sais sulfato de amônio e sulfato de sódio, através da precipitação da proteína por salting-out. Os resultados demonstraram que a concentração inicial teve influência sobre a solubilidade da proteína na fase sobrenadante. O tipo de sal, por sua vez, mostrou efeito significativo sobre a solubilidade da proteína, sendo o sal sulfato de amônio o mais efetivo para indução do saltingout da quimotripsina, seguido do sal sulfato de sódio. Palavras-Chave: precipitação, proteína, sal INTRODUÇÃO O desenvolvimento de novos métodos e novas técnicas de separação e purificação de bioprodutos é essencial para os avanços da área de pesquisas biotecnológicas. O potencial de aplicação ou uso final de um bioproduto irá depender do nível de pureza, por exemplo: um alto grau de pureza é necessário para aplicações terapêuticas ou estudos de estrutura e função de proteínas e um baixo grau de pureza para aplicações industriais como no caso de indústria de alimentos ou detergentes domésticos (Queiroz et al., 2001). As enzimas apresentam uma variedade de aplicações, desde o uso terapêutico e em tratamentos estéticos, até sua utilização na indústria de alimentos para consumo humano e animal. Entretanto, as enzimas não são obtidas puras e a purificação é uma etapa complexa do processo de produção dessas enzimas devido às características dos meios e da variedade das biomoléculas de interesse e contaminantes (Pessoa Junior, 2005). Por isso, uma sequencia de etapas de separação, chamadas de trem de Purificação, é necessária para que se tenha o produto no nível de pureza desejado. O objetivo global da purificação de biomoléculas é a remoção de contaminantes indesejados e também a concentração da proteína desejada e sua transferência para um ambiente onde ela seja estável e pronta para a aplicação a que se destina (Queiroz et al., 2001). Dentre as operações de purificação, a precipitação é uma etapa de recuperação primária altamente eficiente em bioprocessos e presente na maioria dos processos, devido sua capacidade de concentrar em alto grau a molécula de interesse e ao seu baixo custo (Valetti et al., 2012). Porém, por ser uma etapa envolvida na concentração da molécula de interesse, após a precipitação seguem-se etapas de separação de outros contaminantes e dos agentes precipitantes adicionados (Kirkland e Tanner, 2005). Por exemplo, o uso de operações como a diálise é necessária para a eliminação dos sais concomitantemente separados com o precipitado (por coprecipitação ou por arraste do sal contido na fase líquida, que inevitavelmente acompanham o sólido formado). Em etapas seguintes ocorre a separação dos outros compostos de origem biológica. Diferentes métodos podem ser utilizados para precipitação de proteínas, dentre os quais se

2 encontra aquele por adição de sais, também chamada de salting-out. A precipitação com o uso de sais ocorre pela diminuição da solubilidade ocasionada pela dissolução do sal, em que os íons competem com a proteína pelas moléculas de água e quando removida a camada de hidratação, as interações proteína-proteína, principalmente as interações hidrofóbicas, se tornam relevantes (Maurer et al., 2011). A eficiência de operações biotecnológicas relevantes, como a precipitação de proteínas, depende fortemente da compreensão do comportamento de soluções protéicas e das interações envolvidas na formação de agregados de proteína. Estudos relacionados aos agregados protéicos tem se intensificado com a descoberta de que doenças degenerativas (Alzheimer e Parkinson) e outras doenças como encefalopatias espongiformes, diabetes tipo II, catarata e anemia falciforme estão associadas à agregação de proteínas e à separação de fases (Weijers et al., 2008). O entendimento do equilíbrio líquido-sólido que governa a precipitação de proteínas e os fatores que influenciam na formação de agregados amorfos de proteína (por exemplo, temperatura, ph do meio, tipo de sal e concentração inicial de proteína) é de fundamental importância para compreender como estas estruturas protéicas compactas, estáveis e biologicamente ativas são formadas e responsáveis por inúmeras doenças (Blanch et al., 2002). Além disso, o estudo termodinâmico da precipitação de proteínas, envolvendo a solubilidade e o efeito dos sais possibilitaria um melhor conhecimento do processo e um entendimento molecular das interações entre as proteínas e os sais (Ahmad e Dalby, 2011). O objetivo geral deste trabalho é o estudo do efeito de parâmetros como a concentração inicial de proteína e tipo de sal na solubilidade da quimotripsina em solução de sais, através da precipitação da proteína por salting-out. Os sais utilizados como agentes precipitantes foram sulfato de amônio e sulfato de sódio. Os objetivos específicos deste trabalho foram: (i) determinar a influência da concentração inicial da quimotripsina na solubilidade desta proteína em solução de sais; (ii) comparar a efetividade dos sais na precipitação da quimotripsina, através da quantificação da proteína na fase sobrenadante a diferentes valores de concentração de sal. A efetividade dos sais na precipitação de proteínas por salting-out depende fortemente do tipo do sal utilizado. Por isso, diferentes sais foram escolhidos neste trabalho para permitir um estudo comparativo da efetividade dos cátions Na + e NH 4 pelo uso dos sais sulfato de amônio e sulfato de sódio. Ressalte-se ainda que o sulfato de amônio é o sal mais utilizado em precipitação de proteínas, devido a sua alta solubilidade em água, à baixa densidade de suas soluções e ao fato de prevenir o crescimento de bactérias na solução (Deustcher, 1990). Outro sal utilizado na precipitação de proteínas é o sulfato de sódio, um sal efetivo para indução do salting-out, segundo Arakawa e Timasheff (1985). A proteína estudada neste trabalho foi a quimotripsina, uma enzima proteolítica pertencente à família das serino proteases, de massa molecular igual a 25,7 kda e estável a ph 3,0. A quimotripsina é muito utilizada em indústrias farmacêuticas e alimentícias, o que requer a produção desta enzima em elevada quantidade e alto nível de pureza. Assim, a necessidade de purificação da proteína em larga escala e a baixo custo para aplicação industrial, a escassez de dados experimentais de precipitação de quimotripsina aliada a uma melhor compreensão do fenômeno de precipitação por salting-out motivam o estudo a que se propõe este trabalho. Material MATERIAL E MÉTODOS Os sais sulfato de amônio e sulfato de sódio foram obtidos da Merck (Alemanha. A quimotripsina utilizada foi fornecida pela Biobrás (Montes Claros, Brasil). Métodos Determinação da concentração de proteína: A determinação da concentração de proteína em solução foi realizada através do método apresentado por Bradford (1976). A curva de calibração relacionando a absorbância e a concentração de proteína foi realizada para obtenção da concentração de proteína. Precipitação das proteínas com o uso de solução dos sais convencionais e voláteis: Adicionou-se, a um frasco de 1,5 ml de capacidade, a quimotripsina a diferentes valores de concentração, água deionizada e solução dos sais convencionais sulfato de amônio e sulfato de sódio previamente preparada, de modo a produzir uma mistura de composição desejada. Vedou-se o frasco e agitou-se lentamente. A seguir, o frasco foi mantido em repouso em banho termostático a uma temperatura constante de 5 C, por um período de 24 horas, após o qual se separou o

3 sobrenadante e o precipitado por centrifugação a 5000 g. A fase sobrenadante foi diluída em água ultrapura e a concentração de proteína em cada uma das soluções foi determinada pelo método de Bradford. RESULTADOS E DISCUSSÃO Determinação da Concentração de Proteína A determinação da concentração de proteína foi realizada através de uma curva de calibração, que relaciona a absorbância e a concentração de proteína e é apresentada na Figura 1. Concentração de quimotripsina (mg/ml) y = 18,7066x + 0,4346 R² = 0,9870 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 Absorbância a 595 nm Figura 1: Curva de calibração obtida pelo método de Bradford (1976). A equação que expressa a curva de calibração é dada por: y = 18,7066*x + 0,4346 (1) Em que y é a concentração de proteína (mg/ml) e x é a absorbância (nm). A partir da equação (1) pode-se determinar a concentração de quimotripsina em qualquer solução desejada nesta faixa de concentração. O fator de correlação obtido foi igual a 0,9870 indicando que os dados experimentais são correlacionados de modo satisfatório por uma reta. Solubilidade da Quimotripsina em Solução de Sais A solubilidade da proteína a 5 C, representada pela concentração de quimotripsina na fase sobrenadante em função da concentração dos sais sulfato de amônio e sulfato de sódio é apresentada nas Figuras 2 e 3, respectivamente. Observa-se nas Figuras 2 e 3, uma diminuição da concentração de proteína na fase sobrenadante com o aumento da concentração dos sais, evidenciando o efeito salting-out na precipitação da quimotripsina. Concentração de quimotripsina na fase sobrenadante (mg/ml) 7,00 5,00 3,00 1, Concentração de sulfato de amônio (%) Figura 2 Solubilidade de quimotripsina a 5 C em solução do sal sulfato de amônio a diferentes concentrações iniciais de proteína: 20 mg/ml ( ), 30 mg/ml ( ), 40 mg/ml ( ). Concentração de quimotripsina na fase sobrenadante (mg/ml) Concentração de sulfato de sódio (%) Figura 3 Solubilidade de quimotripsina a 5 C em solução do sal sulfato de sódio a diferentes concentrações iniciais de proteína: 20 mg/ml ( ), 30 mg/ml ( ), 40 mg/ml ( ). Comparando-se os sais utilizados na precipitação da quimotripsina, verifica-se que o sal sulfato de amônio foi capaz de precipitar maior quantidade de proteína, já que a concentração da quimotripsina na fase sobrenadante é menor ao se utilizar o sal sulfato de amônio. Por exemplo, para uma concentração inicial de quimotripsina de 20 mg/ml e uma concentração de sal de 70% de saturação, obteve-se uma concentração de proteína na fase sobrenadante de aproximadamente 2,6 mg/ml e 5,1 mg/ml utilizando-se como agente precipitante os sais

4 sulfato de amônio e sulfato de sódio, respectivamente. Estes resultados experimentais mostraram que uma quantidade maior de proteína na fase precipitado é obtida ao se utilizar o sal sulfato de amônio. Como a fase precipitado é a fase desejada, pois é rica em proteína e pobre em sal, o sulfato de amônio mostrou-se o mais efetivo para indução do salting-out da quimotripsina, quando comparado ao sulfato de sódio. Como o ânion sulfato é comum para os dois sais estudados (sulfato de amônio e sulfato de sódio), uma comparação entre os cátions Na + e NH4 + pode ser realizada. Pela série de Hofmeister, sabe-se que o cátion NH4 + é mais efetivo para a indução do salting-out do que o cátion Na + (Scopes, 1994; Ladisch, 2001). Apesar dos ânions exercerem uma influência maior do que os cátions na indução do salting-out de soluções de proteínas, segundo Bénas et al. (2002) os cátions podem afetar a solubilidade de proteínas em até uma ordem de magnitude na mesma força iônica. Observando-se os resultados experimentais verificou-se que de fato, o cátion NH4 + foi mais efetivo para a indução do saltingout da quimotripsina do que o cátion Na +. O efeito da concentração inicial na solubilidade da quimotripsina é apresentado na Figura 4. Verificou-se que a concentração inicial de quimotripsina teve influência sobre a solubilidade da proteína na fase sobrenadante, já que a uma determinada concentração de sal, a concentração de proteína na fase sobrenadante depende das concentrações iniciais utilizadas (20, 30 e 40 mg/ml). Estes resultados estão em concordância ao que foi relatado por Shih et al. (1992) que observaram uma variação da solubilidade da quimotripsina em solução de fosfato de sódio de duas a três vezes com a alteração da concentração inicial de proteína. Segundo Shih et al. (1992), as concentrações de proteína na fase sobrenadante (Cs) são funções aproximadamente lineares das concentrações iniciais (Ci) de quimotripsina. Essa relação linear entre as concentrações de proteína na fase sobrenandante pode ser melhor observada na Figura 4 para o sal sulfato de amônio. Para o sulfato de sódio, este efeito não se mostrou pronunciado devido à proximidade dos valores de concentração de proteína na fase sobrenadante para concentrações iniciais de 20 e 30 mg/ml. Como o sulfato de sódio é um agente precipitante menos efetivo que o sulfato de amônio, possivelmente esta relação linear entre Cs e Ci seria melhor visualizada para concentrações iniciais de quimotripsina maiores que 40 mg/ml. Concentração de quimotripsina na fase sobrenadante (mg/ml) 1 9,00 7,00 5,00 3,00 1, Concentração inicial de proteína Figura 4: Efeito da concentração inicial na solubilidade da quimotripsina em solução de sais de concentração 70% da saturação. Concentrações iniciais de proteína utilizada na precipitação com sulfato de amônio: 20 mg/ml ( ), 30 mg/ml ( ), 40 mg/ml ( ). Concentrações iniciais de proteína utilizada na precipitação com sulfato de sódio: 20 mg/ml ( ), 30 mg/ml ( ), 40 mg/ml ( ). A Figura 4 mostrou também um aumento na solubilidade da quimotripsina, com o aumento da concentração inicial, conforme estudo de Shiau e Chen (1997) para a quimotripsina em sulfato de amônio. Segundo estes autores, esta característica depende do tipo de proteína, sal e ph da solução. Segundo Nelson e Glatz (1985), a precipitação de proteínas ocorre em três etapas, o que explicaria o aumento da solubilidade da quimotripsina com o aumento da concentração inicial. Inicialmente, tem-se a desestabilização da proteína com a adição do agente precipitante. A seguir, tem-se o surgimento da fase sólida com a formação das partículas primárias de proteína. Por fim, estas partículas primárias agregam-se com o tempo. As duas últimas etapas ocorrem simultaneamente. De acordo com este mecanismo, a uma concentração de sal constante, uma elevada concentração inicial de proteína induziria a formação de partículas maiores, porém em menor quantidade e, portanto, uma menor área superficial total estaria disponível para a precipitação. Dessa forma, ocorreria um aumento da solubilidade com aumento da concentração inicial de proteína. CONCLUSÃO Neste trabalho, os ensaios de solubilidade possibilitaram verificar que existe um efeito da concentração inicial (Ci) sobre a concentração de proteína na fase sobrenadante (Cs) expresso

5 através de uma relação linear entre Cs e Ci, em que com o aumento da concentração inicial temse um aumento na concentração de proteína na fase sobrenadante. As curvas de solubilidade da proteína em solução dos sais também mostraram que o sal sulfato de amônio é o mais efetivo para a indução da precipitação da quimotripsina por salting-out. A efetividade dos cátions pode ser comparada com a precipitação da quimotripsina utilizando-se os sais sulfato de amônio e sulfato de sódio, sendo que o cátion amônio foi capaz de atuar fortemente na precipitação da proteína em relação ao cátion sódio, conforme indica a série de Hofmeister. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AHMAD, S. S., DALBY, P. A., Thermodynamic parameters for salt-induced reversible protein precipitation from automated microscale experiments, Biotechnology and Bioengineering, 108, ARAKAWA, T., TIMASHEFF, G. N., Theory of protein solubility. Methods in Enzymology, 114, BÉNAS, P., LEGRAND L., RIÈS-KAUTT, M., Strong and specific effects of cations on lysozyme chloride solubility, Acta Crystallographica Section D, 58, BLANCH, H. W., PRAUSNITZ, J. M., CURTIS, R. A., BRATKO, D., Molecular thermodynamics and bioprocessing:from intracellular events to bioseparations, Fluid Phase Equilibria, , BOERIS, V., ROMANINI, D., FARRUGGIA, B., PICÓ, G., Purification of chymotrypsin from bovine pancreas using precipitation with a strong anionic polyelectrolyte, Process Biochemistry, 44, BRADFORD, M. M., A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, DEUTSCHER, M. P., Guide to protein purification: methods in enzymology, v. 182, Academic Press, San Diego, 894p. KIRKLAND, R. A., TANNER, R. D., Removing proteins from an aerated yeast fermentation by pulsing carbon dioxide: replacing salting-out as a method of protein precipitation, Applied Biochemistry and Biotechnology, , , LADISCH, M. R., Bioseparations Engineering. New York: John Wiley & Sons, p MAURER, R. W., SANDLER, S. I., LENHOFF, A. M., Salting-in characteristics of globular proteins, Biophysical Chemistry, 156, NELSON, C. D., GLATZ, C. E., Primary particle formation in protein precipitation, Biotechnology and Bioengineering, 27, PESSOA JUNIOR, A., KILIKIAN, B.V., Introdução: Purificação de produtos biotecnológicos. In: Adalberto Pessoa Junior e Beatriz Vahan Kilikian. (Org.). Purificação de Produtos Biotecnológicos. Barueri/SP: Editora Manole Ltda, v.1, 444p. QUEIROZ, J.A., TOMAZ, C.T., CABRAL, J.M.S., Hydrophobic interaction chromatography of proteins. Journal of Biotechnology, 87, SCOPES, R. K., Protein Purification, New ayork: Springer-Verlag New York Inc., 3th ed., p SHIAU, K. S., CHEN, T. L., Initial protein concentration effects on precipitation by salt, Biotechnology and Bioengineering, 53, SHIH, Y.C., PRAUSNITZ, J.M., BLANCH, H.W., Some characteristics of protein precipitation by salts. Biotechnology and Bioengineering, 40, VALETTI, N. W., LOMBARDI, J., BOERIS, V., PICÓ, G., Precipitation of chymotrypsin from fresh bovine pancreas using carrageenan, Process Biochemistry, 47, WEIJERS, M., BROERSEN, K., BARNEVELD, P. A., STUART, M. A. C., HAMER, R. J., DE JONGH, H. H. J., VISSCHERS, R. W., Net charge affects morphology and visual properties of ovalbumin aggregates, Biomacromolecules, 9, AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UFU e ao CNPq. Agradecimentos ao Prof. Dr. Everson A. Miranda (UNICAMP) por ter cedido gentilmente a quimotripsina e os sais utilizados neste trabalho.