CRISTALOGRAFIA DE PROTEÍNAS Crescimento de cristais

Transcrição

1 Crescimento de cristais Referências: Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A Practical Approach. Second Edition. Edited by A.Ducruix e R.Giegé.Oxford University Press Protein Crystallization: Techniques, Strategies, and Tips. A Laboratory Manual edited by Terese M Bergfors. (IUL Biotechnology Series) Physical Chemistry of Protein Crystallization. Lectures notes of EMBL Practical Course on Protein Expression, Purification and Crystallization. Bernhard Rupp. (

2 Cristal iônico (forças eletrostáticas) Cristal covalente (ligações covalentes e Van der Waals) Cristal molecular (forças de Van der Waals)

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4 Cristais iônicos e covalentes

5 Cristais protéicos:

6 Cristais iônicos e covalentes: -Sólido - Rígido - Grandes cristais - Privilegia empacotamento. Cristais protéicos: - Sensível ao ambiente (temperatura, condições da solução, etc) - ~50% solvente (possibilita soaking) - Frágil (fácil diferenciar de cristais iônicos) - Pequenos cristais (~10mm 3 ) - Privilegia contato.

7 Requisitos: -Pureza -Solubilidade Cristalizar proteínas é fundamentalmente um experimento de controle de solubilidade. Solubilidade: Quantidade de soluto dissolvido em uma solução em equilíbrio com sua forma cristalina, em uma dada temperatura. Envolve três passos: Nucleação, Crescimento do Cristal e Parada do crescimento.

8 Fatores que influenciam a cristalização (solubilidade) de macromoléculas Parâmetros fisico-químicos intrínsecos: Supersaturação Parâmetros biológicos: Temperatura, ph Raridade da amostra Tempo Fontes biológicas Força iônica Contaminantes bacterianos Difusão e convecção Volume e geometria das amostras e reservatórios Densidade e Viscosidade Pressão, campos eletricos e magnéticos Vibração e sons Seqüência de eventos. Parâmetros Bioquímicos e Biofísicos: Sensibilidade das conformações à parâmetros físicos Ligantes Aditivos específicos Idade da amostra. Pureza: Contaminantes macromoleculares Heterogeneidade seqüencial Heterogeneidade conformacional

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10 Curva de solubilidade: delimita as regiões de subsaturação (abaixo) e supersatuação (acima). Saturação corresponde à condições de solubilidade onde existe cristais em equilíbrio com a solução. Zona de subsaturação: não existem cristais. Proteína totalmente dissolvida na solução. Zona de supersaturação: Contém excesso de moléculas, que aparecerão na fase sólida. Zona de Precipitação: Muito alta supersaturação. Moléculas rapidamente se separam da solução, no estado amorfo. Zona de Nucleação: Supersaturação suficiente para ocorrer a nucleação. Zona Metaestável: Zona de crescimento de e manutenção dos cristais. Não acontece nucleação.

11 Experimentos de Cristalização Difusão de Vapor: Pequenos volume dce proteína e precipitante misturados e a solução é equilibrada contra um grande reservatório contendo o precipitante ou outro agente dehidratante. Gota pendurada Gota sentada Gota sanduiche

12 D I F U S Ã O Sem cristais D E V A P O R Com cristais

13 Experimentos de Cristalização Diálise: A proteína é equilibrada contra um grande volume de precipitante separado por uma membrana de diálise.

14 Salting-out: Decréscimo da solubilidade pelo aumento da força iônica (concentração salina). D I Á L I S E Troca de tampão: É possível aumentar a concentração de um precipitante enquanto se diminui a concentração de outro. Salting-in: Acréscimo da solubilidade pelo aumento da força iônica (concentração salina).

15 Microbatch : Proteína e precipitante são misturados diretamente sobrte uma camada de óleo.

16 M I C R O B A T C H

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18 c(p) D C L+S A F G E B m L c(r) A, B, F, G difusão de vapor; C, D Diálise; E - Batch

19 ESTRATÉGIAS DE CRISTALIZAÇÃO: Screening: Procura pela zona de nucleação em diversas condições. (Preponderantemente empírico GridScreens) Refinamento das condições de nucleação: Teste de novas condições, similares às encontradas na primeira etapa. Otimização: Refinamento nos parâmetros das condições escolhidas com objetivo de obter-se cristais maiores e com melhores conformações.

20 OUTRAS POSSIBILIDADES: Seeding: Mover mecanicamente os microcristais obtidos na zona de nucleação para a zona de crescimento dos cristais. Soaking: Introdução de ligantes da proteína nos cristais. Crio-Cristalização: Introdução de agente crio protetor na solução contendo cristais.

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